瑞香狼毒抗肿瘤作用机制研究进展

2016-04-05宋海平任韶韶肖超宋琪孙京栋马学真

山东医药 2016年21期

关键词：瑞香狼毒细胞周期

宋海平，任韶韶，肖超，宋琪，孙京栋，马学真

（青岛市肿瘤医院，山东青岛266042）

瑞香狼毒抗肿瘤作用机制研究进展

宋海平，任韶韶，肖超，宋琪，孙京栋，马学真

（青岛市肿瘤医院，山东青岛266042）

瑞香狼毒为药用狼毒的正品，具有抗肿瘤作用。其作用机制包括调节肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、调整免疫细胞功能、逆转肿瘤细胞的多药耐药等多个方面。

瑞香狼毒；狼毒；抗肿瘤

瑞香狼毒为瑞香科植物瑞香狼毒的根，又名断肠草、山萝卜、红狼毒，为药用狼毒的正品，盛产于河北、山西、四川等地，其性味苦、平、辛，有大毒，入肝、肺、脾三经。瑞香狼毒治疗肿瘤在我国古代医学典籍中早有记载，《本经》有“狼毒破积聚，治恶疮，消蛊毒”的论述，又有“逐水、祛痰、破积、杀虫”之功效。近年来国内外学者对瑞香狼毒进行了深入系统地研究，认为瑞香狼毒在抗肿瘤研究中的药理实验较多，是一种很有前途的抗肿瘤药物。现对瑞香狼毒的抗肿瘤作用机制作一综述。

1　瑞香狼毒可调节肿瘤细胞周期

细胞周期受多种因子调控，如周期调控蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂等。正常细胞在G1期进入S期，G2期进入M期处均有控制点，DNA损害较轻时，通过内切酶的修复，细胞周期正常进行；DNA损害严重时，不能修复，则启动细胞凋亡程序。肿瘤细胞缺乏这种细胞周期的控制，DNA异常仍能继续繁殖［1，2］。肿瘤作为一种细胞周期疾病，是细胞周期调控紊乱、细胞失控性生长的结果。阻滞细胞周期，是抗肿瘤药物的重要作用方式。

王润田等［3］应用瑞香狼毒甲醇提取物，体外作用于K562细胞，可减少G2、M期细胞数量，增加G0／G1细胞数量，阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞分裂增殖。段盺等［4］报道不同浓度的瑞香狼毒总黄酮微波无水乙醇提取物作用于人肺癌A549细胞48 h后，G0／G1期细胞增加，S和G2／M期减少，表明瑞香狼毒总黄酮提取物可使细胞阻滞于G1期。王敏等［5］研究发现，瑞香狼毒80%乙醇提取物，以盐酸沉淀，氨水析出，获得总含量68.24%总生物碱，对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901有明显G1期阻滞作用，表明瑞香狼毒总生物碱可使细胞停滞于有丝分裂前期。

2　瑞香狼毒可抑制肿瘤细胞增殖

细胞增殖失控是肿瘤细胞的基本生物学特征之一，肿瘤细胞理论上具有无限增殖的能力。肿瘤细胞的增殖包括速度增快、接触抑制减弱、形态改变等。申彦等［6］报道，瑞香狼毒水提取物可抑制膀胱癌T24细胞的生长，用MTT法检测细胞的吸光度及抑制率，发现提取物浓度越高、作用时间越长，抑制作用越明显。段盺等［4］报道，瑞香狼毒总黄酮无水乙醇提取物对人肺癌A549细胞有抑制作用，随着药物浓度增加，作用时间延长，抑制效果显著增强。采用80 mg／L浓度提取物作用A549细胞72 h后，采用MTT法检测细胞活性，细胞增殖抑制率可高达79.3%。王敏等［5］发现，瑞香狼毒总生物碱对体外培养人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402有较强的抑制作用，作用略强于长春新碱，并有较好的剂量依赖性。对人白血病细胞HL-60抑制作用弱于长春新碱。王玉华等［7］将瑞香狼毒水提取物经盐析、透析后获得瑞香狼毒总蛋白，作用于人肝癌SMMC-7221细胞和狗肾MDCK细胞，浓度4 mg／mL时，同时呈现抗肿瘤活性和细胞毒性，且随浓度增加，作用加强。提示蛋白质可能是瑞香狼毒的主要毒性位点。同时发现，瑞香狼毒不同溶剂的提取物均有抗肿瘤活性，证实其细胞毒作用是多种成分协同作用的结果。

阚晓溪等［8］报道，瑞香狼毒乙醇提取物双二氢黄酮类化合物对人肺癌细胞A549抑制作用强于肝癌细胞，抑制率为（60.57±3.83）%～（96.66± 0.51）%，推测肺癌可能是瑞香狼毒的主治癌症之一。Zhang等［9］报道瑞香狼毒的单体成分狼毒素B和狼毒素C具有抑制多种实体瘤细胞增殖的作用。杨乾栩等［10］报道，瑞香狼毒80%乙醇提取物中活性成分狼毒宁B在50、100 μg／mL时，作用于人肺癌细胞A549，与阳性对照药物DDP，具有相同的肿瘤细胞抑制率。药物呈典型的S型浓度药效曲线，与DDP的双曲线型浓度药效曲线不同，推测可能具有不同的药物作用方式。汪群红等［11］报道用瑞香狼毒乙醇提取物新狼毒素A喂饲雄激素非依赖性前列腺癌荷瘤裸鼠，可显著抑制裸鼠移植瘤的生长，抑制率达56.5%。毛刚等［12］用瑞香狼毒水提取物给小鼠灌胃后获得狼毒血清，可显著降低膀胱癌T24细胞的增殖。

研究发现，在多数肿瘤细胞中，端粒酶均有高表达，认为其与肿瘤细胞无限增殖的能力有关。抑制端粒酶的活性，可以达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。刘芳等［13］发现，瑞香狼毒水提取物作用于人肺癌细胞NCI446，可减少端粒酶数量，作用强度与药物浓度呈正相关。瑞香狼毒作为一种传统中药，在我国有广泛的应用。各种民间验方及配合抗肿瘤化疗药物的应用，也取得了良好的效果。段盺等［14］应用瑞香狼毒挥发物注射液肌内注射4 mL，每日2次，联合吉西他滨+DDP方案化疗，治疗中晚期肺小细胞肺癌，较单独应用化疗药物，有效率明显提高，1年生存率达75%，明显抑制肿瘤生长。

3　瑞香狼毒可促进肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是一个主动、有序、基因控制的由一系列酶参与的细胞程序性死亡过程，是保证个体正常发育成熟和维持生理过程中的不可或缺的重要组成。肿瘤的发生发展不仅与细胞过度增殖有关，也与细胞凋亡减少有关。细胞凋亡是肿瘤发展的主要负性调控因素，可阻止肿瘤的迅速增长。瑞香狼毒可以通过激活机体抗肿瘤给基因，增加不同凋亡基因表达，达到诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长的作用。段盺等［4］报道，瑞香狼毒总黄酮无水乙醇提取物作用于肺癌细胞A549 48 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡，提取物浓度80 mg／L时，细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.05）。

Survivin是细胞凋亡抑制蛋白，具有高度的保守性和明显抗细胞凋亡作用，在大部分肿瘤细胞中高表达。Survivin可通过结合活性半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3（Caspase-3）和Caspase-7产生直接抑制作用，也可通过细胞周期抑制蛋白P21间接抑制Caspase而阻止细胞凋亡。申彦等［4］报道瑞香狼毒水提取物在体外可增加膀胱癌T24细胞的凋亡，1.5 g／mL时，凋亡率可达（57.57±3.77）%，并下调细胞中Survivin蛋白的表达，且具有时间、浓度依赖性。

细胞凋亡途径主要包括：死亡受体途径、线粒体途径、内质网应激途径。线粒体参与了大多数细胞的凋亡过程。目前公认凋亡后期的共同途径由Caspases蛋白酶家族激活。死亡受体途径：由细胞外肿瘤坏死因子（TNF）超家族的死亡配体激活，配体与细胞表面死亡受体结合，使受体三聚化并活化Caspase-8，释放入细胞质，启动Caspase的级联反应，激活下游的Caspase-3，6，7，导致细胞凋亡。细胞表面的死亡受体很多，其中经典的有Fas受体和其配体Fas-L；肿瘤坏死因子相关凋亡配体受体（TRAIL-R）和其配体TNF-α。肿瘤细胞表面Fas受体表达增多可促进凋亡，肿瘤细胞内源性Fas-L配体表达增高则有利于肿瘤的生成和转移。TNF-α是目前发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。TNF-α通过与TNFR结合，激活Caspase-8、核因子κB（NF-κB）和JNK信号通路、改变线粒体的通透性等方法诱导肿瘤细胞凋亡。线粒体途径：当细胞内死亡受体非依赖的凋亡刺激转导到线粒体时，线粒体膜电位下降，外膜形成多聚Bax孔道，线粒体内容物如细胞色素C（Cyt-C）、Smac／DLABLO、凋亡诱导因子等蛋白和钙离子流出进入细胞质，引起变构活化Caspase-9，激活下游Caspase-3，6，7，引发级联反应，导致细胞凋亡［15］。同时也可以直接作用于细胞核，引起细胞凋亡。mac／DLABLO蛋白通过拮抗凋亡抑制蛋白，促进凋亡反应的速度和强度，使凋亡顺利进行。Cyt-C在进一步激活Caspase-3的过程中处于核心地位。刘晓霓等［16］报道，采用Annexin V／PI双标法检测肺癌细胞NCI-H157细胞凋亡，瑞香狼毒无水乙醇提取物（ESC、ESC-1、ESC-2）可明显提高NCI-157的凋亡率，上调Fas、TNF-α蛋白的表达，Cyt-C表达无明显影响。ESC可提高Caspase-3，8酶的活性，显著上调Fas-L。ESC-2可提高Caspase-3，8，9酶的活性。ESC-1可显著下调Fas-L、TRAIL-R蛋白的表达；ESC-1、ESC-2可下调Smac蛋白的表达，与其促凋亡作用不一致。提示瑞香狼毒诱导肿瘤细胞凋亡机制复杂，可能存在双向调节作用，是综合调控凋亡通路蛋白表达的结果。

Bcl-2是Bcl-2家族最重要的抗凋亡基因，其编码的Bcl-2蛋白广泛存在于多种肿瘤细胞，主要分布在线粒体外膜、细胞膜内表面、内质网及核膜等处。Bcl-2抗凋亡的机制包括：拮抗促凋亡基因Bax；抑制促凋亡蛋白质Cyt-C自线粒体释放到细胞质；阻止胞质中的Cyt-C激活Caspase；抗氧化及维持细胞内钙稳态（与内质网应激凋亡途径相关）等。Bax基因属于Bcl-2基因家族，是极其重要的促凋亡因素，其编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成二聚体，对Bcl-2产生抑制作用。Bax／Bcl-2的比例是决定细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。Bcl-2基因启动子具有NF-κB结合位点并受其调控，故NF-κB可通过活化诱导Bcl-2等抗凋亡基因而阻止细胞凋亡。NF-κB也通过刺激IL-1β转化酶、C-myc和TNF-α基因表达而导致细胞凋亡。周维等［17］研究发现，用蛋白质印迹法检测技术，体外应用瑞香狼毒水提取物，可通过减少膀胱癌Biu-87细胞的Bcl-2表达，来抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡。马晓莉等［18］报道，酒制瑞香狼毒与生药相比，采用昆明小鼠，给腹水型肝癌细胞株荷瘤小鼠灌胃，可明显抑制肿瘤生长，提高Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达，从而促进肿瘤细胞凋亡。同时提高小鼠体质量，胸腺、脾脏质量无明显下降。

4　瑞香狼毒可调整免疫细胞功能

机体免疫系统具有杀伤肿瘤细胞的能力，肿瘤在长期形成过程中，具有多种免疫逃逸机制。通过免疫刺激剂和免疫调节剂恢复、提高免疫系统对肿瘤细胞的识别、提高体液免疫，是肿瘤防治的重要举措。

张坤娟等［19］研究表明，瑞香狼毒甲醇提取物体外可刺激脾脏细胞增殖，协同ConA刺激对小鼠脾细胞转化。体内可增加小鼠杀伤细胞活性，从而提高细胞免疫功能。樊俊杰等［20］研究发现，瑞香狼毒的水提乙醇沉淀物（主要成分为狼毒多糖）给小鼠灌胃7 d，同时腹腔注射环磷酰胺，检测小鼠免疫功能变化。结果显示：狼毒多糖可显著提高环磷酰胺免疫抑制小鼠的胸腺重量、腹腔吞噬细胞的活性、凝集素滴度、血清溶血素CH50值、小鼠足垫迟发超敏反应。提示瑞香狼毒可提高小鼠非特异性、细胞及体液免疫功能。崔立然等［21］报道用狼毒多糖给移植肉瘤S180荷瘤小鼠灌胃10 d，可增加刀豆蛋白A／脂多糖诱导的荷瘤小鼠T／B淋巴细胞的有丝分裂作用，显著增强有丝分裂原诱导的T／B淋巴细胞增殖，增强荷瘤小鼠免疫应答能力，降低血清中转化生长因子β1（TGF-β1）水平，TGF-β1是一种强效免疫抑制剂，是抑制T细胞增殖及细胞毒活性的主要介导者，称为T细胞抑制因子。狼毒多糖同时增加荷瘤小鼠外周血中细胞毒T淋巴细胞CD8+T的表达，CD8+T是特异性杀伤细胞，作用强，可持续杀伤。狼毒多糖通过激活免疫细胞，降低免疫抑制因子，增强特异性肿瘤杀伤细胞免疫应答，来降低肿瘤免疫逃逸，增强荷瘤机体的免疫监视功能。

5　瑞香狼毒可逆转肿瘤细胞的多药耐药

肿瘤细胞多药耐药（MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因之一，瑞香狼毒多糖可通过逆转化疗药物的耐药，来增强抗肿瘤作用。马健等［22］通过5-FU筛选，诱导出对阿霉素、阿糖胞苷均耐药的肝癌细胞Bel5-FU2000。以瑞香狼毒水提取物给小鼠灌胃，得到其药物血清。药物血清可显著提高阿霉素和阿糖胞苷对肝癌耐药细胞Bel5-FU2000的抑制率，从而逆转耐药。

MDR1编码的p糖蛋白（Pgp）是跨膜转运蛋白超家族成员，为能量依赖性，能将细胞内带阳性电荷的亲脂类化疗药物逆浓度泵至细胞外，使得细胞内化疗药物达不到有效浓度而产生耐药。Pgp高表达被认为是产生多药耐药的最主要原因。多药耐药相关蛋白（MRP）与肺癌耐药相关蛋白（LRP）表达增高也被认为与肿瘤多药耐药有关。李鸿君等［23］报道瑞香狼毒水提取物，终浓度5 g／mL生药，联合DDP分别与人肺腺癌细胞株A549、人肺腺癌耐药细胞株A549／DDP共孵育，较单独应用DDP，对耐药细胞株有明显抑制作用，抑制作用有时间、浓度效应关系。瑞香狼毒和DDP联合用药前，A549和A549／DDP细胞MRP1表达水平差异有统计学意义，联合用药后MRP1表达水平差异无统计学意义。瑞香狼毒和DDP联合用药前，A549细胞MRP1的mRNA水平显著低于A549／DDP细胞，联合用药后，两者差异无统计学意义。即瑞香狼毒通过下调MRP1 mRNA表达水平和MRP1蛋白的表达，逆转肺癌细胞株对DDP耐药。进一步推测瑞香狼毒逆转耐药可能是通过影响跨膜转运蛋白功能而发挥作用。邢立强等［24］报道应用瑞香狼毒水提取物，作用于人小细胞肺癌NCI-H1446和人非小细胞肺癌NCI-H157，用免疫组化SP法分别测定用药前后癌细胞中多药耐药相关蛋白（MDM2）、LRP、热休克蛋白（HSP 27）的表达。结果显示水提取物可抑制NCI-H1446、MDM2、NCI-H157、LRP、HSP27的表达。提示临床应用治疗肺癌，有可能逆转耐药，增强化疗药物的疗效。

综上所述，瑞香狼毒可通过多种分子生物学机制抑制肿瘤的发生发展。这些机制相互联系、相互影响。通过现代抗肿瘤药物筛选机制，筛选瑞香狼毒的有效抗肿瘤单体成分，阐明瑞香狼毒的抗肿瘤作用机制，摸索临床应用的合理剂量，还需进一步深入研究。

［1］Luo JZ，Luo L.American ginseng stimulates insulin production and prevent apoptosis through regulation of uncoupling protein-2 in cultured beta cells［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2006，3（3）：365-372.

［2］王杰，陈腾.蟾毒灵抗肿瘤作用的分子生物学机制研究进展［J］.中药材，2010，33（6）：1011-1015.

［3］王润田，张坤娟，佟慧，等.瑞香狼毒甲醇提取物抗肿瘤机理研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2003，23（9）：734-738.

［4］段盺，贾春芳.瑞香狼毒总黄酮提取物对肺癌细胞增殖及细胞周期的影响［J］.河北医科大学学报，2012，33（30）：308-310.

［5］王敏，王学习，贾正平，等.瑞香狼毒总生物碱的抗肿瘤活性和机理研究［J］.中药材，2010，33（12）：1919-1922

［6］申彦，李建文，张雁钢.瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞Survivin表达的影响［J］.中国医药导报，2012，9（10）：20-21.

［7］王玉华，杨夏，孙丽君，等.蒙药材瑞香狼毒体外细胞毒性的研究［J］.中国医药生物技术，2012，7（2）：9-13.

［8］阚晓溪，王志鑫，杨乾栩，等.瑞香狼毒醇提取物的抗肿瘤活性［J］.中国中药杂志，2013，38（8）：1219-1225.

［9］Zhang C，Zhou SS，Feng LY，et al.In vitro anti-cancer activity of chamaejasmenin B and chamaejasmenin C isolated from the root of Stellera chamaejasme L［J］.Acta Pharmacol Sin，2013，34（2）：262.

［10］杨乾栩，程孟春，王莉，等.活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性成分筛选研究［J］药学学报，2014，49（6）：927-931.

［11］汪群红，陈雪芬，胡敏，等.狼毒乙素和新狼毒素A的抗肿瘤作用［7］.中华中医药学刊，2014，31（11）：2359-2361.

［12］毛刚，王健，陈国俊.瑞香狼毒水提物小鼠血清对膀胱癌T24细胞增殖的影响［J］.中国医药导报，2010，7（16）：16-17.

［13］刘芳，刘华，孙黎.瑞香狼毒提取物作用于人肺癌细胞NCI-446［H446］后端粒酶的定量表达［J］.河北北方学院学报，2008，25（3）：27-29.

［14］段盺，贾春芳.瑞香狼毒治疗肺癌的临床研究［J］.吉林医学，2012，33（12）：2545-2546.

［15］梁欣娜，张兴，滕红丽.中药及其有效成分抗肿瘤作用研究［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：119-122.

［16］杨晓霓，李玉洁，杨庆，等.瑞香狼毒提取物体外诱导肿瘤细胞凋亡作用比较［J］.中国中药材，2012，37（10）：1440-1444.

［17］周维，刘屹立.瑞香狼素水提取物对膀胱癌Biu-87细胞Bcl-2表达的影响［J］.世界中西医结合杂志，2015，10（3）：338-341.

［18］马晓莉，刘晋芝，曹松云，等.酒制瑞香狼毒对荷瘤小鼠抑瘤作用及机制的实验研究［J］.中成药，2013，35（6）：1143-1147.

［19］张坤娟，王润田，王慧芬.瑞香狼毒甲醇提取物抗肿瘤机理初探［J］.中国免疫学杂志，2003，19（8）：544-547.

［20］樊俊杰，贾正平，谢景文，等.瑞香狼毒多糖对环磷酰胺处理小鼠免疫功能的影响［J］.西北国防医学杂志，2000，21（4）：263-265.

［21］崔立然，徐浩，刘吉成，等.狼毒多糖对S180荷瘤小鼠免疫功能的调控作用［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（2）：255-258.