基于间接ELISA检测方法新生仔猪流行性腹泻病探析

古正贤

(四川省内江市威远县高石镇畜牧兽医站，四川内江 642450)

基于间接ELISA检测方法新生仔猪流行性腹泻病探析

古正贤

(四川省内江市威远县高石镇畜牧兽医站，四川内江 642450)

本文为探析新生猪仔的流行性腹泻病毒，构建猪流行性腹泻病毒蛋白间接的ELISA检测方法，从新分离PEDV流行毒株中扩增其N基因，并将N基因克隆至DNA原核表达载体中构建重组质粒，经过诱导的重组蛋白呈可溶性表达。将纯化的N蛋白作为包被抗原建立ELISA检测方法，并且对各种检测条件进行优化优化后确定N蛋白最佳包被条件为37度，该间接ELISA方法为PEDV诊断和流行病学调查提供了有益参考。

新生仔猪；流行性腹泻；病理；DNA原核

1 前言

在国内，尽管导致新生仔猪腹泻的病因很多，但2011年至今以来，学者从表现为呕吐、水样腹泻、迅速脱水、高死亡率为特征的新生仔猪样品中分离到了PEDV。因此，我们可以认为：PEDV是近年来引起新生仔猪腹泻最重要病原。PEDV的N蛋白具有良好的抗原反应性，是制备诊断试剂的主要蛋白。PEDV抗体检测有血清中和试验、免疫电镜观察（IEM）、间接血凝试验（IHA）、免疫组织化学技术、免疫荧光、原位杂交法、RTPCR、ELISA等。目前市面上尚无商品化的PEDV ELISA检测试剂盒，因此建立PEDV抗体ELISA检测方法具有一定现实意义。

2 实验方法

提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物N．F、N．R扩增全长N基因，PCR体系方法参照第二章。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收胶产物后，送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序正确的产物与用XhoI酶切后载体pCold-I DNA 各100 ng，用5xIn-FusionHD Enzyme Premix 50℃连接15 min后转化DE3感受态细胞，具体步骤如下：（1）将连接产物全部加入在冰上刚刚溶解的感受态细胞中，冰浴30 min；（2） 再放入4℃水浴锅中，热激45 S，再冰浴3 min；（3）在无菌操作台中，将冰浴后的产物加入装有1 ml无抗的LB培养基的管中。置于摇床中，200rpm/min37℃震荡1 h；（4）取出EP管，于离心机中4000 rpm离心2 min，弃液保留100L液体；（5） 用枪吹打均匀，于无菌操作台中均匀涂布于含氨苄抗性的LB琼脂平板上。37℃培养14～16 h挑取菌落置于含有氨苄的2YT培养基中，摇菌，PCR鉴定重组表达质粒否正确，提取PCR鉴定正确的质粒，具体步骤：选取N基因克隆阳性菌液，按OMEGA公司质粒抽提试剂盒的说明抽提质粒。

3 间接Elisa方法的建立及实验结果探析

3.1 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

将N蛋白稀释成不同浓的度进行包被，PEDV阳性血清和阴性血清分别从50倍到400倍稀释，方阵滴定结果显示，抗原的最佳包被量为 200 mg/L，血清的稀释度为1：200，此时的阳性血清与阴性血清的OD450 11121值相差最大（P/N=9.736）。

3.2 最佳包被液、最佳封闭液及封闭时间的优化结果

用不同包被液以包被酶标板，用不同的封闭液对包被的酶标板按不同时间进行封闭，试验结果表明，用O．05 M碳酸盐包被液包被抗原，5%脱脂乳37度封闭2 h时，P/N值最大。此时为最佳条件。

3.3 血清与酶标二抗的最佳作用时间的优化结果

按上述确定条件进行实验，将血清按20 min、30 min、45 min、60 min四个时间段作用，洗三次后，将稀释好的酶标二抗按20 min、30 min、45 min、60 min四个时间段作用，根据OD450测定结果，计算P/N值，确定最佳血清孵育时间为20 min，最佳二抗孵育时间为60 min。

3.4 显色温度与时间的优化

按上述条件实验，最后显色时，分别用室温和37℃，显色时间为5 min，10 min，15 min，进行ELISA测定，分析实验结果表明，37℃显色15 min，为最佳底物显色温度时间，此时P/N值可达21.760。

4 结果与讨论

PEDVN蛋白是一种磷酸化的核衣壳蛋白，它与基因组RNA紧密结合，是PEDV中所占比例最大的一种结构蛋白，且其高度保守，具有良好的抗原反应性和特异性。能诱导机体快速产生较高水平的特异性抗体，可作为PEDV早期感染的诊断依据。在文中我们成功分离到了一株PEDV流行毒株SH6，由于目前国内外对PEDV研究尚不深入，对该病的准确监测仍存在技术难关，因此，建立实用的PEDV实验室检测方法迫在眉睫。酶联免疫吸附试验是一种常用的经典血清学检测方法，它操作简便、灵敏度高，特异性强。目前市面上有一些以全病毒抗原为基础的商品化PEDV检测试剂盒，但该病毒不易分离培养，因此难以制备大量抗原。此外，这些ELISA试剂盒还可能存在排散病毒的隐患。本研究扩增其N基因，以pCold．I DNA作为原核表达载体，构建pCold-I-N重组质粒，并将其转化感受态细胞BL21（DE3），目的蛋白在上清液中高效表达。采用NioNTA柱对重组蛋白进行纯化，得到浓度为1.5 mg／mL的目的蛋白。Westernblot分析表明该蛋白具有良好的抗原反应性。利用纯化的重组蛋白，初步建立问接ELISA检测方法，优化各项反应条件。问接ELISA优化后条件为：最佳包被液O.05 M碳酸盐缓冲液（pH 9.6），最佳抗原包被量为200 ng/孔，最佳包被条件为374C包被2 h，最佳封闭条件为5%脱脂乳37度封闭2 h，最佳血清稀释度为1：200，血清最佳孵育时间为37度孵育20 min，二抗最适稀释度为1：2x104，二抗最佳孵育时间为40 min，临界值为＞0.394时判定为阳性，OD450 rim_＜0.345时判定为阴性，0.345～0.394为可疑。并对50份已知背景血清进行检测，符合率达94%。

[1] 吕茂杰，陈建飞，时洪艳，等.猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J].微生物学报，2011，51 （5）：643-647.