强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞及血清PD-1、HLA-B27水平变化

宋红林，孟保福，李艳霞，韩晶，王营伟

(安阳市人民医院，河南安阳 455000)

强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞及血清PD-1、HLA-B27水平变化

宋红林，孟保福，李艳霞，韩晶，王营伟

(安阳市人民医院，河南安阳 455000)

目的 观察强直性脊柱炎(AS)患者外周血淋巴细胞及血清程序性死亡受体1(PD-1)、人类白细胞抗原B27(HLA-B27)水平变化，并探讨其意义。方法 选择AS患者40例(观察组)、同期健康体检者40例(对照组)，采用流式细胞术检测两组外周血淋巴细胞膜型PD-1和HLA-B27表达率，ELISA法检测血清可溶性PD-1和HLA-B27水平。取观察组淋巴细胞，加入或不加入终浓度为5 μg/mL可溶性PD-1配体PD-L1，进行微量淋巴细胞毒试验(MLCT)，对淋巴细胞死亡率进行评分。结果 观察组和对照组外周血淋巴细胞膜型PD-1表达率比较无统计学差异(P>0.05)，观察组外周血淋巴细胞膜型HLA-B27表达率及血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均高于对照组(P均<0.05)。观察组加入和不加入可溶性PD-L1的淋巴细胞MLCT评分分别为(2.63±1.24)、(3.05±1.00)分，评分比较有统计学差异(P<0.05)。结论 AS患者外周血淋巴细胞膜型PD-1表达无明显变化，血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均明显升高，其发病可能与PD-1/PD-L通路介导的免疫抑制信号有关。

强直性脊柱炎；程序性死亡受体1；人类白细胞抗原B27

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性进行性自身免疫炎症性疾病，主要累及脊椎等中轴关节和肌腱韧带骨附着点，致残率高[1]。AS发病原因不明，除与人类白细胞抗原B27(HLA-B27)高度表达有关以外，免疫共刺激分子的参与，尤其是程序性死亡受体1(PD-1)等免疫负性分子失调是其发病的关键因素[2]。PD-1分为膜型和可溶性两种形式，其在B细胞、树突状细胞和T细胞上激活后表达会增加，与两个配体PD-L1和PD-L2结合后，介导细胞信号通路中的负性调节，协同发挥共刺激分子作用，可能与AS病情进展相关[3]。本研究观察AS患者外周血淋巴细胞膜型PD-1、HLA-B27及血清可溶性PD-1、HLA-B27的水平变化，探讨其与AS发病的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年8月～2015年7月我院收治的AS患者40例(观察组)，男24例、女16例，年龄20～60岁、平均36岁，病程12～50个月、平均28个月。选择同期健康体检者40例(对照组)，男22例、女18例，年龄18～65岁、平均39岁。AS诊断均符合1984年美国纽约修定标准[4]，排除合并其他自身免疫性疾病及严重心、肝、肾脏疾病者[5]。两组性别、年龄具有可比性。

1.2 外周血淋巴细胞膜型PD-1及HLA-B27表达检测 采用流式细胞术。采集两组空腹静脉血6 mL，其中3 mL置于不加抗凝剂的采血管中，凝集30 min；3 500 r/min离心5 min，收集血清，避免溶血和高脂血标本，分装后置于-20 ℃冰箱保存待测。另外3 mL置于肝素抗凝采血管内，Ficoll密度梯度离心法收集外周血淋巴细胞，在5×105/mL淋巴细胞悬液中加入PE标记鼠抗人HLA-B27单抗1 μL；4 ℃结合30 min；PBS洗涤后，再加入FITC标记鼠抗人PD-1单抗1 μL，4 ℃结合30 min；PBS再次洗涤后，采用直接荧光标记法检测膜型PD-1及HLA-B27表达率。采用Pearson积矩法分析两组外周血淋巴细胞膜型PD-1和HLA-B27表达率的相关性。

1.3 血清可溶性PD-1及HLA-B27水平检测 采用ELISA法。取出1.2中冰箱保存待测的血清标本，室温融化，避免反复冻融。严格按照ELISA试剂盒说明书操作，分别检测两组血清可溶性PD-1和HLA-B27水平。显色后双波长比色，根据标准品比色数值和对应浓度绘制的标准曲线查出标本水平。采用Pearson积矩法分析两组血清可溶性PD-1与HLA-B27水平的相关性。

1.4 可溶性PD-L1对观察组淋巴细胞死亡情况的影响 采用微量淋巴细胞毒试验(MLCT)。取观察组淋巴细胞，加入或不加入终浓度为5 μg/mL可溶性PD-L1，每例样本均设置4个平行复孔、1个阴性对照孔和1个阳性对照孔。将淋巴细胞浓度调整为1×106/mL，用微量连续加样器将细胞悬液加入到抗血清板上，每孔1 μL，室温孵育30 min。加入兔补体5 μL，室温孵育1 h；加入5%伊红2 μL，室温反应2 min；加入36%中性甲醛固定，4 ℃培养过夜。次日于倒置显微镜下观察，依据血清板对淋巴细胞死亡情况进行评分。评分标准：当阴性对照孔内淋巴细胞没有死亡，并且阳性对照孔内淋巴细胞全部死亡时，淋巴细胞死亡率>50%记1分，≤50%记0分，4个平行复孔得分相加，为该例样本最终得分，最高4分、最低0分。如果阴性孔内有死亡淋巴细胞或阳性孔内有成活淋巴细胞，则重复试验。

2 结果

2.1 两组外周血淋巴细胞膜型PD-1、HLA-B27表达率比较及关系分析 观察组和对照组外周血淋巴细胞膜型PD-1表达率分别为7.08%±2.51%、7.29%±2.62%，两组比较P>0.05；观察组和对照组外周血淋巴细胞膜型HLA-B27表达率分别为64.70%±24.86%、10.47%±3.73%，两组比较P<0.05。观察组和对照组外周血淋巴细胞膜型PD-1、HLA-B27表达率均无明显相关性(r分别为0.25、-0.22，P均<0.01)。

2.2 两组血清可溶性PD-1、HLA-B27水平比较及关系分析 观察组和对照组血清可溶性PD-1水平分别为(71.62±27.07)、(52.28±18.82)ng/mL，两组比较P<0.05；观察组和对照组血清可溶性HLA-B27水平分别为(58.90±16.83)、(19.13±6.95)U/mL，两组比较P<0.05。观察组血清可溶性PD-1与HLA-B27水平呈正相关(r=0.52，P<0.05)，对照组血清可溶性PD-1、HLA-B27水平无明显相关性(r=-0.04，P<0.01)。

2.3 可溶性PD-L1对观察组淋巴细胞MLCT评分的影响 观察组加入和不加入可溶性PD-L1的淋巴细胞MLCT评分分别为(2.63±1.24)、(3.05±1.00)分，评分比较P<0.05。

3 讨论

AS患者体内存在多种协同刺激分子失衡，造成免疫调节紊乱，从而导致疾病的发生、发展[6]。临床生物标志物HLA-B27和AS的发病有密切联系，我国AS患者HLA-B27的阳性率为90%左右[7，8]。本研究结果显示，观察组膜型HLA-B27表达率明显高于对照组，但是与文献报道的90%左右阳性率有一定差别。分析原因，可能由于本研究中样本量较少，收集病例时间较长，不能排除已经进行治疗的AS患者，因此对HLA-B27的检测结果造成了一定影响。研究显示，HLA-B27的表达对负性分子PD-1影响不大[9]。

HLA-B27高表达同时，可能也有其他免疫分子的变化，一般表现为免疫功能亢进，形成对骨骼关节的炎症反应。PD-1/PD-L是B7/CD28家族中一对重要的协同刺激分子，PD-1是1992年发现的CD28超家族成员之一，由2号染色体上的PDCD1基因编码。PD-1主要在活化的T、B和NK淋巴细胞上呈诱导性表达，随细胞活化逐步上调表达，与其配体PD-L(PD-L1和PD-L2)相互作用，提供T淋巴细胞活化抑制信号。因此，PD-1/PD-L途径对T淋巴细胞在免疫应答过程中发挥适当而有效的调节具有重要意义，与自身免疫、肿瘤、感染等疾病的发生也密切相关[10，11]。

除膜型PD-1外，在人外周血中还存在可溶性PD-1，而且其水平与自身免疫病的发生密切相关。本研究观察组可溶性PD-1水平明显高于对照组，而两组膜型PD-1表达则没有明显差异。这些升高的可溶性PD-1可能来源于膜型分子，机体内一些细胞膜表面的协同刺激分子可从细胞表面裂解，并脱落成为可溶形式。另外，PD-1基因也存在多种天然的mRNA剪切体，其中缺失编码跨膜区外显子的剪切体，最终翻译为可溶性PD-1蛋白。由于可溶性PD-1的增多，过度结合配体PD-L，使得配体不能充分与膜型PD-1结合，从而干扰正常的免疫抑制；免疫细胞始终处于活化状态，持续释放免疫激活信号，最终发生免疫炎症反应[12]。

MLCT过程中，在分离出来的免疫细胞培养环境内，加入抑制信号分子PD-L1，可以体外模拟免疫抑制信号[13]。本研究观察组加入可溶性PD-L1后淋巴细胞MLCT评分低于不加入可溶性PD-L1的淋巴细胞，说明可溶性PD-L1可减少淋巴细胞死亡。分析原因，可能是膜型PD-1的胞质区含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序和一个免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)，膜型PD-1结合了足够配基PD-L1，PD-1/PD-L1相互作用后触发ITSM募集信号分子SHP-2，引发抑制信号的产生，致使效应T细胞失去作用，导致补体介导的细胞穿孔效应缺乏必要的应答部位[14]。本研究AS患者血清可溶性PD-1与HLA-B27水平呈显著正相关，提示AS患者血清可溶性PD-1与HLA-B27之间能够相互调节，从而影响疾病的发生和发展[15]。

综上所述，AS患者外周血淋巴细胞PD-1表达无明显变化，血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均明显升高，其发病可能与PD-1/PD-L通路介导的免疫抑制信号有关。

[1] 杜旭娜,李晏,张胜利,等.强直性脊柱炎病情活动度评分对强直性脊柱炎患者病情活动性判断的价值[J].中华内科杂志,2012,51(3):206-209.

[2] Zhou L, Zhang Y, Xu H, et al. Decreased programmed death-1 expression on the T cells of patients with ankylosing spondylitis[J]. Am J Med Sci, 2015,349(6):488-492.

[3] 马婷婷,肖广辉,诸葛欣.PD-1及其配体表达异常与动脉粥样硬化的关系研究进展[J].山东医药,2014,54(35):90-92.

[4] 中华医学会风湿病分会.强直性脊椎炎诊治(草案)[J].中华风湿病杂志,2003,7(10):641-644.

[5] 耿光辉,武丽君,李彩萍.髋关节受累的AS患者X线、CT及MRI检查结果分析[J].山东医药,2015,55(17):41-43.

[6] 陈蕊雯,王勇,孙树汉,等.强直性脊柱炎易感基因的研究进展[J].遗传学报,2005,32(10): 1108-1114.

[7] 赵晓君,薛鸾,陈云飞,等.三种方法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的效果比较[J].山东医药,2011,51(43):48-49.

[8] 满斯亮,李宏超,颜淑敏,等.血清25-(OH)VD3及β-CTX与强直性脊柱炎病情活动度的相关性观察[J].山东医药,2015,55(36):74-76.

[9] 张华,骆方军,周佳斌.程序性死亡因子PD-1及其配体在强直性脊柱炎患者外周血的变化[J].现代实用医学,2010,22(6):695-696.

[10] Shinohara T, Taniwaki M, Ishida Y, et al. Structure and chromosomal localization of the human PD-1 gene (PDCD1) [J]. Genomics, 1994,23(3):704-706.

[11] 张永红,廖爱华.PD-1/PD-L1信号通路在妊娠中的研究进展[J].中国免疫学杂志，2015,31(1):126-130.

[12] 王师,罗龙龙,吕明,等.PD-1/PD-L1信号通路及其在肿瘤中的应用[J].国际药学研究杂志,2015,42(2):143-147.

[13] 徐悦蓉,杨安钢,温伟红.负性共刺激分子阻断抗体用于肿瘤治疗的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(1):125-128.

[14] 王宝英,宋爱华,李涛,等.PD-1/PD-L1信号通路在免疫调节中的研究进展[J].现代检验医学杂志,2014,29(3):124-126.

[15] Soleimanifar N, Amirzargar AA, Mahmoudi M, et al. Study of programmed cell death 1 (PDCD1) gene polymorphims in Iranian patients with ankylosing spondylitis[J]. Inflammation, 2011,34(6):707-712.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.019

R593.23

B

1002-266X(2016)16-0055-03

2015-12-21)