基于知识发现工具Arrowsmith探求防己与附子配伍减毒机制的研究＊

王仁杰，萧 伟**

（1. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

基于知识发现工具Arrowsmith探求防己与附子配伍减毒机制的研究＊

王仁杰1,2，萧 伟1,2**

（1. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

目的：探求防己与附子配伍减毒的可能机制。方法：非相关文献知识发现工具ARROWSMITH在线软件。结果：防己中的有效成分粉防己碱对包括L-型钙离子通道在内的钙离子通道具有拮抗作用，而L-型钙离子通道也是附子中乌头碱在引发心率失常过程中起关键作用的离子靶点。结论：防己可能通过其有效成分粉防己碱对心肌细胞膜上的L-型钙离子通道进行阻滞，从而对抗附子中乌头碱引起心肌细胞内钙离子增加而导致的心律失常，进而发挥配伍解毒的作用。基于非相关文献知识发现法得到的知识关联结果，不仅能为研究者提供新的研究思路，亦可为科学研究提供更为全面的数据支持。

防己 附子 非相关文献知识发现 Arrowsmith L-型钙离子通道

在当今的大数据时代，生物医学领域产生了庞大的数据信息量。在文献存储、利用都完全数字化的如今，传统的检索方式已经不能满足人们对某一方面知识信息的系统需求。基于密集数据分析的科学发现成为继实验科学、理论科学和计算科学之后的第四范例。芝加哥大学的Swanson教授研制的基于非相关文献的知识发现工具Arrowsmith，可以很好地解决因专业信息分散而导致的跨学科间知识不能相互关联的问题，在国外的生物医学研究中得到了广泛的应用，尤其是在细胞生物反应的调节机制、确定复杂性疾病病因、药物副作用等方面为临床或实验室研究提供了线索和思路，部分研究结果已经得到证实[1-3]。

附子是毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeliDebx的干燥侧根，具有强心、镇痛、消炎、抗癌等药理作用，附子有毒，其毒性物质主要是二萜类生物碱，如乌头碱、中乌头碱、次乌头碱是附子中毒性最强的3种生物碱，它们的小鼠口服LD50分别为1.8、1.9、5.8 mg·kg-1[4]，以乌头碱的毒性最强。附子中的生物碱成分具有显著的生物活性，同时也是其毒性成分，其毒性反应为呼吸抑制、心律失常、休克，甚至死亡[5]。成方中多与其他中药配伍以减毒，如甘草、干姜、大黄、地黄、芍药、防己、人参等[6]。防己辛苦大寒、补阴泻阳，与附子配伍可通痹止痛，有相反相成、扬长避短之妙，且具有增效减毒的作用，历来中医常用作治疗风湿痹症[7]。现有的防己附子两药配伍研究报道比较少，主要有配伍后药液中化学成分的变化，如川乌与防己按1:1和1:2的比例配伍后，乌头碱的煎出量比单煎时分别降低了38.8%和42.9%，与两药配伍后提高川乌LD50的药理研究结果一致[8]。也有涉及两味药配伍后成分在体内的代谢变化，如在应用超高液相色谱-质谱结合主成分分析法研究制川乌和防己配伍前后的肠内菌代谢差异时发现：与防己配伍后，苯甲酰次乌头原碱相对含量高于制川乌单煎液，而中乌头胺、Excelsine、苯甲酰中乌头原碱、尼奥灵、塔拉胺、次乌头碱的相对含量均有所降低，且制川乌的体内生物转化过程亦受影响，研究结果表明这些标志物经肠内菌生物转化后的含量差别可能是其配伍前后药效差异的原因[9]。关于防己附子配伍在靶点分子水平上进行解毒机制的相关研究目前鲜见报道。本文以PubMed数据库中的英文文献为分析对象，利用非相关文献知识发现工具-Arrowsmith，尝试探求防己与附子配伍在分子水平上的解毒机制，得到了一些有意义的结果。

1 方法

登陆Arrowsmith网页版http://arrowsmith. psych.uic.edu/cgi-bin/arrowsmith_uic/start.cgi，点击“start”进入检索界面。以“Radix Stephaniae Tetrandrae [Title/Abstract] OR Fangji [Title/ Abstract]”为检索式形成的文献集作为来源文献A，以“Aconitine [Title/Abstract]”为检索式形成的文献集作为来源文献C。结果A集合中的30篇文献与C集合中929篇文献没有一篇文献在标题或文摘字段中同时含有防己和乌头碱。而连接文献集合A和C的中间词表B中有193个词，这些词分别出现在防己或乌头碱的相关文献的标题或文摘字段中，按照相关度从高到低排列，相关度大于0.5（即有密切关联关系）的词有68个。

本研究旨在探讨防己与附子配伍后对乌头碱的解毒机制，因此选择“Chemical & Drugs”和“Genes & Molecular Sequences， and Gene & Protein Names”对相关词表B进行语义筛选，相关度大于0.5（0.55- 0.99）的11个词被筛选出来。进一步阅读文献，发现其中有研究意义的关联词为钙通道（Calcium Channel）。与中间关联词相关的6篇PubMed文献中有4篇与研究主题密切相关，其PMID为：1787886[10]、7543723[11]、9114566[12]、1288827[13]。文献7543723认为乌头碱对大鼠心肌细胞L-型钙离子通道具有显著的阻滞作用，其机制在于使钙通道的开放时间缩短和开放概率减小；文献9114566的报道也指出：乌头碱对L-型钙离子通道有轻微的阻滞作用，且不改变通道动力学特征；文献1288827介绍：乌头碱作为一种钙通道阻滞剂，会引起细胞内钙水平的变化，从而加重维拉帕米戒断综合症的心脏毒性。

综上所述，1997年之前，国内外的一些相关研究得出的结论认为乌头碱对L-型钙离子通道起阻滞作用。然而，防己中的粉防己碱也是一种钙离子通道（L-型）阻滞剂[10，14-17]，这与两者配伍解毒的实际效果不统一。其后，通过对乌头碱的现代分子毒理学机制研究文献[18-20]的深入分析，了解到后来的研究者一致认为乌头碱可以引起L-型钙离子通道电流密度增加，从而细胞内钙离子浓度升高。以往的结论得到纠正的同时，也提示：L-型钙离子通道是防己附子两药配伍解毒的一个关键靶点。

2 结果

防己中的有效成分粉防己碱是一种天然的钙离子拮抗剂，可通过阻滞电压依赖性或受体中介的钙离子通道（如L-型钙离子通道），非特异性抑制钙离子的跨膜转运[21]；而L-型钙离子通道被认为是附子中主要毒性成分乌头碱导致严重心律失常过程中起关键作用的离子靶点之一。粉防己碱对L-型钙离子通道的阻滞作用，可能是其对抗乌头碱所致心脏毒性的作用机制之一，亦即潜在的防己与附子配伍解毒机制之一。

附子中的双酯型二萜类生物碱是其主要活性成分，同时也是其毒性成分，可导致严重的心律失常和心脏毒性。中医临床使用时，常运用以甘缓毒、以收约散、以寒制热、以柔克刚的配伍方法，与甘草、干姜、大黄、黄芩、浙贝、人参、防己等形成配伍，达到增效减毒的目的。现代科学研究显示其配伍解毒的机制有：共同煎煮时与其他成分（如甘草酸）形成不溶物降低溶出率，或形成络合物在体内实现缓释，或增加了双酯型生物碱的水解，如与山茱萸配伍时可抑制次乌头碱的溶出而解毒[22]，与大黄配伍时双酯型生物碱络合生成难溶的复合物，而与炙甘草、白芍、干姜配伍时双酯型生物碱可转化为毒性小的脂型生物碱[23]。在体内代谢时，毒性生物碱可与葡萄糖醛酸等生物活性物质结合生成络合物，由尿排出；另外，也有一些较为深入的机制研究涉及解毒成分通过与心肌细胞膜上起关键作用的靶点结合，从而对抗其产生的心脏毒性，如研究表明甘草苷抑制钠离子通道的开放是其对抗乌头碱毒性的作用机制之一[6]。

现有关于乌头碱引起心律失常的机制研究已比较深入。现代分子毒理学机制研究表明：乌头碱可促进钠离子通道电流（INa），增加内向整流钾电流（IK1）以及L-型钙离子通道电流（ICa-L），抑制瞬时外向钾电流（Ito），明显延长动作电位时程（APD），增加后除极发生率，引起折返冲动，诱发快速型心律失常[18，19]。其中L-型钙离子电流、内向整流钾电流、钠内流可能是心律失常发生中起关键作用的离子靶点。乌头碱改变心肌细胞膜上一系列离子电流的机制是影响相关通道基因的表达。如，使钠离子通道基因（SCN 5A）表达上调，导致心肌细胞膜钠离子通道失活关闭不正常，钠离子内流增加[24]；促进L-型钙离子通道基因（Cavl 2）的mRNA表达，引起L-型钙离子通道电流密度增加，细胞内钙离子浓度升高[20]；降低瞬时外向钾电流基因（Kv43）的mRNA表达，改变Ito，从而导致APD平台期延长，复极异常，引起复极时程的离散和后除极的发生，导致心律失常[25]。

L-型钙通道属于电压依赖性钙通道，其开放与关闭主要取决于膜电位的变化，属长时程钙通道。心室肌细胞膜上的钙通道以L型钙通道为主，生理情况下细胞内钙浓度上升主要取决于细胞内钙释放，经L型钙通道产生的内向钙电流是内钙释放触发的主要机制[26]。ICa-L主要在快速去极化时引起动作电位的传导，参与心肌动作电位平台期的形成和维持。L-型钙离子通道电流的升高会导致心肌细胞内钙超负荷，而各种细胞内钙增加将会引发心律失常。广泛的相关研究结果显示，L-型钙通道编码基因的突变会导致包括Brugada综合征在内的多种类型的遗传性心律失常[27]。Sun等发现，由于L-型钙通道编码基因表达上调而引起的钙离子浓度增加，可能是脑缺血所致严重心律失常的可能机制之一[28]。Timothy综合征是一种由于L-型钙离子通道基因（Cavl 2）的突变所致的多器官异常及心律失常综合征。Cavl 2基因G406R的突变不仅改变了其电压依赖性失活动力学，而且显著减缓了通道时间依赖性失活，导致L型钙通道“功能增强”，动作电位平台期内向电流增加，QT间期延长。在后续研究中发现，L-型钙离子通道阻断剂（尼索地平）能抑制突变通道显著增强的钙离子内流，因而具有治疗Timothy 综合征的潜力[29]。

粉防己碱，又称汉防己甲素，是粉防己中提取的一种双苄基异喹啉生物碱，是一种常见的来源于天然产物的L-型钙离子通道阻滞剂[10，14-16]。近些年的研究表明，粉防己碱可通过阻滞电压依赖性或受体中介钙离子通道，抑制细胞外钙离子内流以及细胞内钙离子的动员，从而保护心肌细胞免受损伤[17]。根据以上充足的研究证据可以推测，粉防己碱通过非特异性抑制钙离子的跨膜转运，对抗乌头碱引起的细胞内钙离子浓度升高，从而阻止严重心律失常的发生。这可能是防己附子配伍减毒的机制之一。

另有研究报道粉防己碱对钾离子通道也有影响，如骆红艳等[30]研究发现，粉防己碱可对IK的外向部分有激活作用，这种激活作用可能是其降低心肌收缩力、抗高血压和抗心律失常的作用机制之一；税青林等[31]的实验结果表明，一定浓度下的粉防己碱对心肌细胞钾通道具有阻滞作用。对粉防己碱的相关研究也涉及到了钠离子通道，Chen等研究发现粉防己碱对人心房细胞钠离子通道有显著抑制作用[32]。研究者在粉防己碱对钙离子通道阻滞作用的认识上基本一致，但其对钾离子和钠离子通道的影响，目前各家意见并不统一，研究也不够深入和广泛，所以还不能形成合理的推论。

3 讨论

科学研究需要对提出的问题进行分析，推测出可能的答案，然后进行实验验证。在这个过程中，我们又需要结合自身经验通过阅读大量的已有研究文献来了解前人的研究进展，从而全面分析问题，设计出逻辑严密、科学合理的实验方案。但在同一个研究主题下的各个细分专业、交叉学科的诸多文献杂乱分散在数据库中，使得大部分研究者经常只能从自身熟悉的专业背景中收集相关资料，而忽视了交叉学科的相关科研信息。

Swanson教授基于非相关文献知识发现的研究结果表明，立足于生物医学领域的大数据资源进行文献间关联关系的研究，常常会有意外的、令人惊喜的收获，为研究者带来独特的视角和科研思维的革新[33，34]。同时，非相关文献知识发现的研究结果也为科研假设提供了更为全面、翔实的事实根据和数据支持，对于未来试验的设计，将从过去的假设验证模式转变为基于数据分析的预测验证模式，对学术研究的基本方法产生重大影响。利用知识发现工具Arrowsmith对防己和附子配伍解毒的可能机理从文献情报学的角度寻觅新的线索，可为下一步创新科学研究提供合理假设。当然，得到的科研假设最终还需要依赖于科研实践，不能取代传统的经验式科学研究；它是建立在传统科学研究的文献基础之上，并与其形成互补的一种创新思维实践研究。

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Latent Mechanism of Detoxification in Combination of Radix Stephaniae Tetrandrae and Radix Aconiti Lateralis Preparata Using Knowledge-discovery Tool Arrowsmith

Wang Renjie1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical, Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001 China)

Software of ARROWSMITH based on the theory of Swanson’s non-correlated literature-bases knowledge discovery was used to study the latent relationship between Radix Stephaniae Tetrandrae and toxicity of Radix Aconiti Lateralis Preparata. Tetrandrine has an antagonistic effect on calcium channel, including L-type calcium channel. And the L-type calcium channel also plays a key role in arrhythmia process triggered by aconitine. It may be the latent mechanism of detoxification in combination of Radix Stephaniae Tetrandrae and Radix Aconiti Lateralis Preparata. The study indicated that non-correlated literature-bases knowledge discovery not only broadened the thinking of scientists but also provided more comprehensive data for scientific research.

Radix Stephaniae Tetrandrae, Radix Aconiti Lateralis Preparata, non-correlated literature-bases knowledge discovery, Arrowsmith, L-type calcium channel

10.11842/wst.2016.03.032

R252.7

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2015-03-19

修回日期：2016-01-04

＊ 科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09402203）：现代中药创新集群与数字制药技术平台，负责人：王振中。

＊＊ 通讯作者：萧伟，本刊编委，博士，博士生导师，研究员级高级工程师，主要研究方向：中药新药的研究与开发。