前交叉韧带损伤后膝关节腔uPA含量变化及意义

吴 波，梁晓松，罗永忠，姜晓玲，孙 磊

基础医学

前交叉韧带损伤后膝关节腔uPA含量变化及意义

吴 波，梁晓松，罗永忠，姜晓玲，孙 磊＊

目的 探讨前交叉韧带损伤后膝关节腔内u－PA变化情况及意义。方法40只新西兰兔一期建立单侧前交叉韧带损伤模型。损伤术后2周、3周和4周时采用ELISA方法检测膝关节液中u－PA含量变化。损伤术后3周时采用HE染色和免疫组织化学检测关节腔内滑膜组织病理变化和u－PA表达情况。结果前交叉韧带损伤后膝关节腔内u－PA生成增加，术后3周时关节腔内u－PA含量明显高于假手术组（P＜0.05）。术后3周时组织学检测显示滑膜组织病理变化明显，滑膜组织内u－PA广泛表达、阳性细胞数量增多（P＜0.01）。结论前交叉韧带损伤后膝关节腔内u－PA含量增加，可能与滑膜组织病理改变有关。

前交叉韧带损伤；尿激酶型纤溶酶原激活物（u－PA）；滑膜；兔

前交叉韧带损伤 （anterior cruciate ligament，ACL）是常见的膝关节韧带损伤，损伤后韧带通常不能自行愈合，但其具体机制尚不清楚［1］。近年来，随着研究深入人们逐渐认识到除了力学因素以外，韧带损伤后关节腔内生物学微环境同时发生变化，并对韧带损伤愈合产生重要影响。Murray等［2］观察到ACL损伤后缺损部位始终未见修复组织充填，指出这可能与损伤后关节腔微环境变化有关。尿激酶型纤溶酶原激活物 （urokinase－type plasminogen activator，u－PA）是对纤维蛋白组织形成起关键调节作用，同时还与炎症反应、基质降解等多种病理过程有关［3］。目前，人们对ACL损伤后膝关节腔内u－PA的变化尚不清楚，本文拟通过动物实验初步探讨ACL损伤后u－PA的变化及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 兔u－PA ELISA试剂盒（上海朗顿），u－PA一抗 （武汉博士德），自动酶标分析仪 （美国BioRAD），切片机（德国Leica），显微镜系统（日本Olympus），IPP医学图像分析系统 （美国 Media Cybernetics）等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及手术 新西兰大白兔40只，体质量（3.0±0.2）kg，雌雄各半，山东鲁抗提供。取36只为实验对象，接受ACL手术处理。研究对象按时间点随机分为三组，即2周、3周及4周组，每组各12只。另外4只为假手术组作为对照。实验组对象均接受单侧ACL横断处理。麻醉起效后，消毒铺单，做膝前正中切口，切开内侧支持带，脱位髌骨，显露关节腔，在ACL实质部将其完全横断并做2 mm缺损，冲洗关节腔，逐层缝合，关闭切口。术后常规预防感染，患肢不固定，分笼饲养，正常饮食，自由活动，观察进食、活动及切口愈合情况。假手术组仅行关节切开术。

1.2.2 关节液u-PA含量检测 分别于ACL损伤术后2周、3周和4周时，取相应实验组对象的关节液进行检测，并取假手术组关节液作为对照。采用ELISA试剂盒检测不同时间点各组关节液内u－PA含量变化情况。

1.2.3 组织形态学检测 ACL损伤术后3周时，处死实验组和假手术组对象取滑膜组织进行HE染色、免疫组织化学检测，观察滑膜组织病理学变化和u－PA表达情况。每张切片取5个高倍视野（10× 40）观察计数，比较u－PA阳性细胞数量变化情况。

1.3 统计学分析 通过IPP医学图像系统进行检测，采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料以表示。采用方差分析比较各组之间关节液u－PA含量差异，采用t检验比较滑膜组织内u－PA阳性细胞数量变化情况，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别之间关节液u-PA含量变化情况采用ELISA方法检测ACL损伤术后2周、3周、4周组及假手术组实验对象关节液u－PA水平 （表1）。研究结果显示，各组对象之间关节液内u－PA水平差异明显（P＜0.01）。尤其是，在ACL损伤后3周时关节液中u－PA水平明显高于假手术组 （P＜0.05）。

表1 ACL损伤后不同时间点关节腔u-PA水平变化（）

组别 n u－P A水平（n g / m l）2周组 1 2 1 4 1 5.2 9 ± 2 3 9.0 6 3周组 1 2 1 7 3 4.7 6 ± 2 4 2.9 5 4周组 1 2 1 5 0 5.8 6 ± 1 6 1.5 5假手术组 4 1 4 6 5.1 7 ± 2 1 4.1 1

2.2 病理学检测 ACL损伤后3周时，HE染色结果显示膝关节腔内滑膜大量增生，滑膜组织明显增厚，其内有大量细胞增殖和血管形成。假手术组滑膜菲薄，未见炎性细胞浸润及血管增生。研究结果提示ACL损伤后关节腔内滑膜组织出现炎性增生的病理变化。

2.3 滑膜组织u-PA表达情况 ACL损伤后3周时，研究采用免疫组化检测滑膜组织内u－PA阳性表达情况。研究结果显示，损伤后增生滑膜组织内可见u－PA广泛表达，大量阳性细胞聚集。相反地，假手术组滑膜内u－PA呈低水平表达，阳性细胞稀少。实验组滑膜组织内u－PA阳性细胞数较对照组明显增高 （37.5±6.8/HPF v.s 4.2±1.9/HPF，P＜0.01）（图1）。研究表明，ACL损伤后病理状态下滑膜组织内u－PA表达水平明显增高。

3 讨论

目前临床上通常采用韧带重建方法治疗ACL损伤，但是仍然存在着腱骨愈合、止点重塑、本体感觉恢复等问题尚未彻底解决。因此，深入研究ACL损伤愈合机制，对进一步提高ACL损伤治疗效果有着重要意义。早期有研究发现ACL损伤后韧带组织也表现出损伤修复变化，经历炎症反应、细胞长入，滑膜增生、血管形成及细胞增殖、韧带塑形等过程。然而，损伤韧带最终仅形成被滑膜组织包裹的残迹，而未能形成有效的组织连接［4］。内侧副韧带损伤后韧带通常能够较好地自我愈合，在其损伤修复区域可见纤维蛋白组织形成。这种重要的修复组织充填可以为后续修复细胞长入、增殖提供必要场所。然而，即使是在力学稳定的ACL中央型损伤模型中，韧带损伤部位也未能形成纤维组织充填［2，5］。由此可见，除了力学稳定性之外，ACL损伤后关节腔内生物学微环境也发生改变，并对韧带损伤修复产生重要影响。

纤维蛋白组织形成是一种普遍的病理现象，广泛存在于血液凝结、血栓形成、炎症反应和组织修复等多种病理变化过程中。皮肤、肝和骨组织等组织损伤修复区域均可见纤维蛋白组织形成［6］。纤维蛋白形成和降解之间存在着动态平衡，不同病理状态下这种平衡可能发生改变。纤维蛋白组织降解受到纤维蛋白溶酶的调控，纤维蛋白溶酶原在纤维蛋白溶酶原激活物调控下转变为具有酶活性的纤维蛋白溶酶。u-PA是一种丝氨酸蛋白酶，能够水解纤维蛋白溶酶原转变为纤维蛋白溶酶。u-PA不仅在纤维蛋白溶解过程中起着关键作用，还在炎症反应、基质降解、细胞迁移、组织修复及肿瘤转移等多种病理过程中起着重要作用［7，8］。

Murray等［2］曾指出膝关节液中纤溶酶可能影响了韧带损伤区域内纤维蛋白组织的形成。本文研究结果显示ACL损伤后关节液内u-PA含量水平明显增高，关节腔内滑膜组织大量增生、细胞增多，并且高水平表达u-PA。研究结果表明，ACL损伤后关节腔内生物学微环境发生重要变化，u-PA可能对韧带损伤修复过程产生不利影响。相关研究还发现u-PA与多种关节疾病密切相关。王维山等［9］研究发现膝骨性关节炎患者血浆和关节液中u-PA含量水平明显高于正常体检者。另外有研究显示炎性因子IL-1β能够通过JNK-Akt-F-κB a信号通路刺激人软骨细胞u-PA表达增强，可能与膝骨性关节炎病理改变有关［10］。Yang等［11］研究发现非甾体抗炎药可通过抑制损伤软骨u-PA形成、减少滑膜反应，进而对骨性关节炎起保护作用。

上述相关研究表明在疾病、损伤等病理状态下膝关节腔微环境内u-PA形成增加，与组织损伤修复、关节破坏、疾病发展等密切相关。本文研究表明ACL损伤后关节腔内生物学微环境发生改变，关节内u-PA含量水平增高，可能与关节内滑膜组织增生有关。本项目研究对进一步加深ACL损伤修复过程认识，提高其治疗效果有着重要意义。

［1］Murray MM，Fleming BC.Biology of anterior cruciate ligament injury and repair：Kappa delta ann doner vaughn award paper 2013［J］.J Orthop Res，2013，31（14）：1501-1506.

［2］Murray MM，Spindler KP，Ballard P，et al.Enhanced histologic repair in a central wound in the anterior cruciate ligament with a collagen-platelet-rich plasma scaffold［J］.J Orthop Res，2007，25（9）：1007-1017.

［3］Jin T，Tarkowski A，Carmeliet P，et al.Urokinase，a constitutive component of the inflamed synovial fluid，induces arthritis［J］. Arthritis Res Ther，2003（5）：R9-R17.

［4］Murray MM，Martin SD，Martin TL，et al.Histological changes in the human anterior cruciate ligament after rupture［J］.J Bone Joint Surg Am，2000，82-A（10）：1387-1397.

［5］Yoshioka T，Kanamori A，Washio T，et al.The effects of plasma rich in growth factors（PRGF-Endoret）on healing of medial collateral ligament of the knee［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2013，21（8）：1763-1769.

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［7］Gibson DJ，Schultz GS.Molecular wound assessments：matrix metalloproteinases［J］.Adv Wound Care（New Rochelle），2013，2（1）：18-23.

［8］McMahon B，Kwaan HC.The plasminogen activator system and cancer［J］.Pathophysiol Haemost Thromb，2008，36（3/4）：184-194.

［9］王维山，董金波，何 斌，等.OA患者血液及关节液中MMP-3、uPA水平检测及临床意义［J］.山东医药，2011，5（1）：63-64.

［10］Yeh CC，Chang SF，Huang TY，et al.Shear stress modulates macrophage-induced urokinase plasminogen activator expression in human chondrocytes［J］.Arthritis Res Ther，2013，15（2）：R53.

［11］Yang SF，Hsieh YS，Lue KH，et al.Effects of nonsteroidal antiinflammatory drugs on the expression of urokinase plasminogen activator and inhibitor and gelatinases in the early osteoarthritic knee of humans［J］.Clin Biochem，2008，41（1/2）：109-116.

［2016－02－16收稿，2016－03－14修回］ ［本文编辑：韩仲琪］

The levels change and its significance of urokinase-type plasminogen activator in articular cavity after anterior cruciate ligament injury

WU Bo①，LIANG Xiao－song，LUO Yong－zhong，etal.Department of Orthopaedics，the 88th Hospital of Chinese PLA，Taian，Shandong 271000，China

Objective To investigate the levels change and its significance of urokinase－type plasminogen activator in articular cavity after anterior cruciate ligament injury.MethodsForty New Zealand rabbits were employed in this study and the transection of anterior cruciate ligament was created in the unilateral knee.The concentrations of urokinase－type plasminogen activator in joint fluid were detected by ELISA postoperatively at 2，3，and 4 weeks after injury.At 3 weeks after injury the pathological change and expression of urokinase－type plasminogen activator were further evaluated in the synovium.ResultsThe level of urokinase－type plasminogen activator in joint fluid had dramatically changed.The levels of urokinase－type plasminogen activator were significantly elevated at 3 weeks after injury than that of sham operation group（P＜0.05）.At 3 weeks after injury the pathological changes were proven significant in the synovium.Moreover，in the synovium the expression of urokinase－type plasminogen activator was elevated and the number of the positive cells markedly increased（P＜0.01）.ConclusionThe levels of urokinase－type plasminogen activator in the knee joint are significantly increased which may be related to the pathological changes of the synovium.

Anterior cruciate ligament injury；Urokinase－type plasminogen activator（u－PA）；Synovium；Rabbit

R686：R684

A

10.14172/j.issn1671－4008.2016.08.020

山东省自然科学基金资助项目（ZR2014HQ010；ZR2013 HM010）

271000山东泰安，解放军88医院全军骨科中心 （吴波，梁晓松，罗永忠，孙磊），病理科（姜晓玲）

孙磊，Email：sl88h@163.com