CAR-T 细胞疗法的研究进展

陈明月，秦玉花，张 伟，杜鹏强，张亚平

(1.郑州大学，河南 郑州 450003；2.河南省人民医院，河南 郑州 450000)



CAR-T 细胞疗法的研究进展

陈明月1,2，秦玉花2*，张 伟2，杜鹏强2，张亚平2

(1.郑州大学，河南 郑州 450003；2.河南省人民医院，河南 郑州 450000)

近年来，随着生物技术研究的进展，利用基因工程合成的嵌合抗原受体的 T 细胞(CAR-T)在血液肿瘤疾病治疗方面的疗效明显，成为肿瘤治疗的研究热点。本文就 CAR-T的治疗血液系统肿瘤得试验应用及改进做一个简要概述，为今后的研究提供参考。

CAR-T；细胞治疗；肿瘤；临床试验

近年来，癌症发病率呈逐年上升和年轻化趋势，癌症的常规治疗方法包括手术、放射、化学药物治疗、介入、氩氦刀、射频、热疗、中医治疗等，虽然这些方法对于减轻肿瘤负荷见效快，但各有弊端，手术风险大，造成机体损伤；放疗时有些部位不易照射到，对机体免疫、造血系统造成损伤；化疗毒副作用大，对机体免疫、造血系统同样造成损伤；介入治疗会造成栓塞，由于使用化学药物，同时会存在副作用；氩氦刀对较大且不规则的病灶效果不好；射频、热疗对正常组织损伤也较大；中医治疗常作为一种辅助手段，长期用药造成机体耐药性。这些常规治疗方法，并不能杀灭全部肿瘤细胞，这也为日后肿瘤的复发埋下了伏笔。随着生物技术的发展，NK、DC-CIK、TCR-T/CAR-T 等细胞治疗手段如雨后春笋般的出现，生物免疫疗法也成为癌症治疗新领域，而CAR-T细胞疗法被研究者们认为是最有希望成为治愈肿瘤细胞的方法。

1 CAR-T技术的产生

1.1 CAR-T技术产生的背景

研究发现肿瘤组织可产生的反映肿瘤自身存在的化学物质，即肿瘤标志物，通过医学检测可以证实，肿瘤标志物虽与肿瘤相关，却并不能完全用于肿瘤的诊断，肿瘤的最终确诊还是病理学，临床上发现的肿瘤时，大部分为中晚期，此时患者自身的免疫功能已经紊乱，肿瘤周围的免疫抑制微环境和肿瘤细胞不表达或低表达 MHC分子，使免疫细胞不能准确发现并清除肿瘤细胞。在治疗肿瘤的过程中，除了常规治疗方法，还需要对肿瘤细胞精准的杀伤或消灭，从而彻底控制微小病灶和转移的肿瘤细胞，于是，在研究者们不懈的努力下，CAR-T 技术应运而生。

1.2 CAR-T治疗的步骤

CAR-T即嵌合抗原受体的 T 细胞，CAR-T的治疗主要包括5个步骤：第一，人工合成CAR；第二，从肿瘤患者体内分离获得淋巴 T 细胞；第三，利用基因工程的方法把设计好的 CAR 转入T细胞中；第四，体外筛选并扩增；第五，检测合格后输注到患者体内。

1.3 CAR-T的设计合成

CAR的基础设计中包括胞外铰链区、肿瘤相关抗原结合区(scFV段)、跨膜区和胞内信号转导区。肿瘤相关抗原结合区的合成对于CAR的特异性、有效性以及改造后T细胞的安全性是决定因素；胞内信号转导区的设计对于 CAR的细胞活化、细胞刺激的持久性、细胞存活时间起着重要作用。

CAR设计完成之后要通过转导进入T细胞，目前主要使用的转导方法包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、电转导等。应用病毒作为载体转导效率较高，但存在安全风险，使用电转导效率较低，表达不稳。

在CAR-T设计中发现CAR的关键作用部位在于特异性抗原的选择和胞内信号转导区，由于肿瘤细胞不表达或低表达MHC分子，选择一个特异性好的肿瘤标志物又十分困难，目前对CAR的优化主要集中在胞内信号转导区上。

1.3.1 第一代CAR-T的设计合成 第一代 CAR-T 胞内信号转导区仅有一个 CD3ζ域，它介导的 T 细胞激活是通过 CD3ζ链或免疫球蛋白 Fc 受体的γ链完成。由于 CAR-T 的细胞表面受体与靶细胞的表面抗原结合，与肿瘤 MHC 无关，不需要抗原加工处理，缺少与抗原提呈细胞的相互作用，在体内抗肿瘤活性受到了限制[1-3]，肿瘤细胞的清除还需要 CAR-T 细胞表面表达的协同刺激信号。

1.3.2 第二代CAR-T的设计合成 为克服第一代CAR-T的限制，第二代CAR-T结合了协同刺激受体(CD28或 4-1BB)，它来源于 T 细胞的激活模型，协同刺激受体提供了 T 细胞激活信号，增强了 T 细胞介导的抗肿瘤效应[4]，使源自 T 细胞受体和 CD3复合体的信号扩大。与第一代 CAR-T 相比，协同刺激受体的加入能够促进 T 细胞的增殖、分泌细胞因子、分泌抗凋亡蛋白，另外细胞作用时间增长[5-8]。

1.3.3 第三代CAR-T的设计合成 为了进一步改良CAR-T的设计，第三代CAR-T在胞内信号转导区加入了多个信号结构域(ICOS，4-1BB，OX40，CD27，CD28，DAP10)，用以增强CAR-T的激活与持久性。不同的研究表明第二代CAR和第三代 CAR 的比较结果并没有质的变化[4]。目前的研究还不能确定第二代和第三代哪个更胜一筹，不过第二代和第三代CAR-T都已有各自的临床试验。

1.3.4 第四代CAR-T的设计合成 由于第二代、第三代CAR-T缺乏对CAR-T增殖和杀伤的限制，很容易导致肿瘤溶解综合症(TLS)和细胞因子释放综合症(CRS)，第四代CAR-T在特异性抗原的选择域前端加入了一个重组抗体的双功能启动开关，该开关是由一个肿瘤治疗性抗体的Fab片段和一个多肽抗原表位构成，用于控制CAR-T的杀伤和增殖。

2 CAR-T 细胞的相关试验及改进

2.1 第一代CAR-T细胞试验

Lamers 等[9]报道了以 CAIX 为抗原设计的一代 CAR-T治疗转移性肾透明细胞癌。在接受治疗的8名患者中，5名采用直接输注，出现了肝炎症状，其余患者在输注前注射了抗 CAIX单克隆抗体，这种治疗前预处理没有使患者出现肝炎症状，分析原因可能是改造的 CAR-T对自身同样表达CAIX抗原的胆管细胞进行了攻击，注射抗CAIX单克隆抗体可能封闭了胆管细胞CAIX的表达，免受了靶向攻击。另外，第一代设计的CAR-T在患者体内存活时间较短没有出现客观的临床效果。

Jensen 等[10]报道了以CD19为特异性抗原的 CAR-T治疗滤泡性淋巴瘤细胞和以 CD20为特异性抗原的 CAR-T 治疗成熟 B 细胞淋巴瘤，同样由于改造 CAR-T 细胞在体内持续时间较短没有出现客观的临床效果。

第一代CAR-T的临床试验虽然没有较好的治疗效果，但间接证明了CAR-T设计的可行性，为后续的 CAR-T 改进和临床应用积累了宝贵的经验。

2.2 第二代CAR-T细胞试验

Kochenderfer 等[11]报道了1例非霍奇金淋巴瘤(NHL)使用以CD19为特异性抗原的二代CAR-T配合白细胞介素-2 进行治疗，治疗前接受了环磷酰胺和氟达拉滨的化学药物治疗，结果显示：在 27 周内，使用定量 PCR 在患者外周血里一直能检测到CAR-T的存在，患者32 周时淋巴瘤得到了缓解， 29 周时出现 B 细胞再生障碍性贫血。

Kalos 和 Porter 等[12,13]报道了使用了加载 4-1BB 以 CD19为特异性抗原的二代 CAR-T 治疗3名慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者，治疗前接受了化学药物治疗，结果显示，改造后的CAR-T细胞扩增了近万倍，回输后发生转移，在6个月内，使用流式和定量 PCR 在病发位置骨髓检测到并呈高表达，其中2名患者完全缓解，1名患者部分缓解，但是导致了肿瘤溶解综合症(TLS)和细胞因子释放综合症(CRS)，另外，出现了 B 细胞再生障碍性贫血、浆细胞数量减少和低丙种球蛋白血症。

2.3 第三代CAR-T细胞试验

Morgan 等[14]报道了使用同时加载 CD28和 4-1BB 协同刺激受体、靶向 ERBB2 的三代 CAR-T 治疗1名结肠癌并伴有肺、肝转移的患者，治疗前接受了环磷酰胺和氟达拉滨的化学药物治疗，在输注了1010 的 CAR-T 细胞后，过量的 CAR-T 细胞攻击低表达 ERBB2 的肺上皮细胞，引起肺部毒性，并伴随细胞因子释放综合症，导致多器官衰竭，患者在第5天死亡。

传统的 CAR-T对表达CD19抗原的复发性B细胞急性淋巴细胞白血病已经成功临床应用，但是传统的CAR-T在体内激活和扩增缺乏控制，CAR-T细胞快速增殖，这导致肿瘤溶解综合症的严重病例(TLS)和细胞因子释放综合症(CRS)，在患者体内遇到抗原阳性细胞时，引起并发症，例如，改造的抗 CD9 CAR-T不加区分的杀死恶性B细胞和正常B细胞，导致长期的B细胞发育不全。目前，第四代CAR-T已被研究者设计，重点在于改善 CAR-T的杀伤启动。

2.4 第四代 CAR-T 细胞试验

David 等[15]报道了以CD19为特异性抗原在CAR-T的特异性抗原的选择域前端加入一个聚合小分子，从而使CAR-T的杀伤活性可调，并在B细胞白血病的啮齿动物中成功实验，防止了CRS和TLS的发生，报道表明该方法适用于异质性和耐药肿瘤人群，如血液肿瘤和实体瘤。

目前报道的CAR-T细胞治疗成功案例多是在治疗血液肿瘤方面，在实体瘤临床试验方面却少有成功[16-18]，主要是多种因素如肿瘤抗原丢失、趋化因子等，阻碍 CAR-T 细胞进入肿瘤区域，另外，肿瘤周围微环境如pH值、氧化应激、免疫抑制抑制细胞因子、调节性 T 细胞、骨髓源的抑制性细胞[19]、肿瘤局部氧化应激等[20],使肿瘤细胞增殖[21]，使周围淋巴细胞表现出高水平 DNA 氧化[22]，也不利于免疫杀伤。 Ligtenberg MA等[23]报道了通过基因工程改造 T 细胞，使 T 细胞共表达过氧化氢酶和嵌合抗原，从而保护浸润 T 细胞免受肿瘤周围氧化应激介导的免疫抑制。

CAR-T 细胞在临床试验方面的改进令人兴奋，但CAR-T的研究仍处于初级阶段，目前的 CAR-T 仍受限于固定的抗原特异性，缺乏理想的肿瘤特异性抗原，需要进一步克服肿瘤肿瘤周围的微环境，CAR-T的稳定性和安全性还要进一步的改进验证。相信通过研究者们前仆后继的努力，CAR-T细胞治疗会得到进一步的优化，期待不久的将来，CAR-T细胞治疗会真正成为肿瘤治愈的有效方法。

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本文编辑：王知平

陈明月，女，药师，硕士研究生在读

秦玉花，女，主任药师，E-mail: cmy19910215@163.com

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