快速DNA指纹分析技术在个体识别中的应用

刘亚举，岳俊涛

快速DNA指纹分析技术在个体识别中的应用

刘亚举，岳俊涛

目的 结合实际案例，探讨快速DNA技术在个体识别案件中的应用。方法 分别从实验室快速STR扩增试剂盒和现场一体化DNA检验设备两个方面进行说明，列举了采样工具及检材处理流程、扩增试剂及成分配比优化、电泳检测及数据分析等对快速检验的影响。结果 两者在案件中均取得了成功的STR分型结果，其相应的快速检验流程能够满足日常案件检验需求。结论 个体识别DNA快速检验与分析可以被充分应用到案件实战中，对促进DNA证据的及时提取与鉴定具有重要的意义。

法医遗传学；快速DNA指纹分析；STR技术；个体识别

DNA个体识别技术由经典的3个步骤组成，即DNA提取、PCR扩增、毛细管电泳，而快速DNA分析研究主要集中在3个环节的检验时间缩短上，也有直接省去DNA提取步骤的[1-2]。不管怎样，都会带动DNA规模化样本检验，促进个体识别DNA证据价值的快速应用。

1 案例资料

案例1：2014年1月下旬，农妇李某(女，46岁)被杀死在家中，其上身着红色保暖衣，下身赤裸，仰卧于床上，系锐器致颈动脉破裂死亡。在死者咖啡色床单上和卧室垃圾篓内分别发现6根脱落毛发和3枚烟蒂。提取上述检材和使用NUCLEIC-CARDTM(美国AB公司)提取死者血样，排查出的数百名嫌疑人血样使用FTA卡(美国GE公司)提取。剪取死者血样采集卡和烟蒂咬痕部斑迹，以及带有毛囊的毛发2根，将上述检材放入0.2 mL的PCR管(鼓盖)中，直接加入Prep-n-GoTM缓冲液3 μL，离心10 s，然后在室温中静置10 min，最后加入12 μL的GlobalFilerTMExpress试剂盒(美国AB公司)PCR反应混合液(Master Mix6μL、Primer Set6μL)。按照试剂盒说明书进行直接扩增检验，置3500XL型遗传分析仪上毛细管电泳，Collection软件收集数据，用GeneMapperID-X软件进行STR分型。

案例2： 2015年5月中旬，王某(女，17岁)约见网友时，被3名男子灌醉，然后在宾馆遭到轮奸。使用斑迹查找系统(激光)和佩戴防炫目眼罩(美国Leeds公司)，发现粉红色的床单和被罩上有大小不等的荧光反应区5处，最大2.6 cm×1.7 cm、最小1.8 cm×1.1 cm，以及8根脱落毛发；在床头柜和地面上有饮料瓶4个、烟蒂10枚。提取上述检材和使用Bode Buccal DNA CollectorTM装置(美国AB公司)收集受害人口腔拭子，排查出的嫌疑人员的血样使用国产专用采集卡(武汉骥腾公司)提取。用4N6FLOQSwabsTM植绒拭子(意大利COPAN公司)擦拭饮料瓶口，剪取受害人口腔拭子采集卡、植绒拭子、烟蒂咬痕部斑迹、床单被罩上斑迹检材适量，以及带有毛囊的毛发2根，将上述检材直接利用RapidHIT 200快速检测系统(美国IntegenX公司)和配套的试剂耗材进行DNA检验(其中扩增试剂为GlobalFilerTMExpress)，用GeneMarkerTMHID V2.7.1软件(美国SoftGenetics公司)进行STR分型。

两个案件均得到了完整的STR分型，相关DNA分别与受害人(死者)、嫌疑人的分型一致。

2 讨论

2.1 检材的快速检验流程

检材的快速检验前提条件是有效发现遗留于犯罪现场的生物检材，茚三酮薰显法对人体接触细胞(汗斑类)[3]、菲德倍斯试剂对唾液斑类[4]、近红外反射照相对深色衣料上血迹等有一定的指示作用[5]，可提高此类生物检材的发现率。而联苯胺血痕预试验对后续STR分型影响较大，可能使血痕不能继续进行STR分型检测[6]，短波紫外激光照射会对汗潜手印检材的DNA检验结果产生严重影响[7]，而对血迹、唾液斑、有毛囊的毛发的DNA检验结果影响较小[8]。激光光源光纯度高、方向性强、光斑均匀，光源在防炫眼罩的配合下可以去除深颜色底物对精斑和血痕的掩盖；鲁米诺试验是血红蛋白或正铁血红素的氧化活性，在反应中显现荧光，可以将微量血痕进行放大表现，引起人视觉上的感应[9]。

2.2 检材的采集和储存

人体生物样本，如血液和唾液，一般选择纸质承载体，包括FTA卡类(FTA卡、NUCLEIC-CARDTM)和非FTA卡类(Bode Buccal DNA CollectorTM装置、OmniSwabsTM、S&S903滤纸)。用纸质承载体采集的检材或样本，在后继检验中须用洗液进行特殊处理，而且价格昂贵，不建议使用。优质采集卡应具备以下条件：①纸厚度在(0.093±0.002) cm范围，如果纸片过薄，在使用打孔器取样时容易漂移，过厚则不能使液体快速吸收且均匀渗透和扩散，采集的样本不是双面血痕，降低后续检验结果的成功率。②纸灰分在0.1%±0.001%范围，以保证纸浆纯度。③杀菌防腐情况，经纳米银或磷酸盐溶液处理[10]，具有抗菌、防腐及杀菌效果。

现场生物检材，现场人体接触细胞的采样方法有双拭子擦拭、粘取、剪取、压力吸附等[11-12]，要将采集到的细胞高效率转移到后期DNA检验环节，就要视情况而定。通常双拭子擦拭法转移承载体有纱线(不常使用)、棉签(尖头，方便微量检材浓缩集中，利于DNA直接扩增)、植绒拭子，如果是干的需要借助液体，如无菌去离子水、纳米银或磷酸盐溶液[10]。其中植绒拭子检验效果较为明显，其表面的原子数目在体系中所占的比例较大，表面效应十分突出。对于粗糙接触面的作案工具上述擦拭和粘取则效果不明显，把EZ-tape胶带制成双面胶带(双面胶带之间的夹心为海绵，胶带宽度1.5 cm左右，胶粘性略低于EZ-tape)，使用时将胶带一面贴于蓝色或黄色枪头上，另一面胶带借助枪头外力来提取客体上的人体细胞。压力吸附的滤膜应为厚度小于0.2 mm、孔径100～200 μm之间的纤维膜，孔径大小不一，纤维成无序排列，这样的滤膜韧性较强，可以有效拦截脱落细胞。另外，还有高效现场DNA物证采集仪(Microbial-Vac Systems，简称M-Vac DNA采集仪)是利用湿法真空原理，首先在一定压力下将一种无菌的收集液喷洒到被采集样品表面，然后利用真空吸力将这些收集液和样品表面人体细胞一起收集，最终在收集瓶中将收集液和表面微粒分离，达到高标准回收生物检材。

血卡和唾液卡上的人体细胞较为丰富，直接装在透气的牛皮纸袋内即可。有些把承载体原物提取的现场检材，可以用一次性医用布包装，随后在DNA实验室转移和检验。人体细胞类检材可采用套管式储存[13]，透明塑料套管内的变色硅胶和干燥片(与检材保持一定距离)能实现检材的无损、干燥、可视化储存，防止检材的污染、损耗、腐败霉变。为了达到检材的识别，常用的有二维条形码、物流条形码编码，有发展趋势的是无线射频识别技术(radio frequency identification,RFID)，与前者比较，RFID具有非接触、阅读速度快、无磨损、不受环境影响、寿命长和防冲突功能。

2.3 检材的预处理方法

DNA提取法：小体积Chelex100+PK法，IQ磁珠法(Promega公司)、M48磁珠法(Qiagen公司)、AGOWA sbeadex磁珠法(LGC公司)、PrepFiler磁珠法(AB公司)，硅胶膜法(Qiagen公司)，硅珠法，既可手动操作又可在工作站上进行(目前使用最广泛的自动化提取平台有Maxwell®16、EZ1 Advanced/XL、Hamilton STAR-LET、Automate Express、QIAcube)，方便使用。磁珠优劣主要取决于磁珠颗粒的大小，纳米级的最好。另外，对于性侵案件中的精子—阴道上皮细胞混合斑，一直都是至关重要的生物物证，而两者的分离也一直是法医检验中的难点。传统的“两步消化”分离法虽然能满足案件需求，但耗费时间较长。采用免疫磁珠定向捕获精子细胞的方法[14]，可以定向捕获混合斑中的精子细胞，能够分离开女性上皮细胞与精子细胞，并能得到准确的精子DNA分型结果，这种方法可快速分离出精子。

免DNA提取(即直接扩增法)：一般使用协同作用的缓冲液，基于FTA卡类型样本，加入Low TE buffer或纯水即可[9]；非FTA卡类型检材，配用Punch Solution试剂(Promega公司)或Prep-n-GoTMBuffer(AB公司)，而唾液类样本，加入Swab Solution试剂(Promega公司)需70 ℃孵育样本30 min，Prep-n-GoTMBuffer则需室温孵育样本20 min，因此根据不同的扩增试剂盒应采用不同的缓冲液达到增效作用[15-16]。另外，采用多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)是一种全基因组扩增(whole genome amplification, WGA)技术，其针对样本全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，目的是在无序列倾向性的前提下大幅增加样本DNA总量。为保证模板高度精确复制，说明书中要求模板DNA量大于10 ng。实际上法医微量检材得到的模板DNA量远远低于10 ng，结果会造成杂合子基因座扩增不平衡、等位基因丢失等问题。因此，该技术和方法应用于单一来源微量生物检材DNA检测时，结果的判读要慎重，为避免这种现象的出现，建议在同等条件下重复数次PCR扩增。

2.4 扩增系统和程序优化

PCR扩增反应是DNA检验中的关键环节，传统STR分型技术因受限于聚合酶及热循环技术参数，PCR扩增过程需要约3 h以上，如果能进一步缩短，将有利于提高鉴定效率。快速PCR是一种基于普通PCR原理，通过改进DNA聚合酶、调整反应添加剂和调整热循环参数等[17]，实现较短时间内高效扩增目的片段的检测技术。为实现快速检验，一些快速热循环仪、微流控芯片技术已被研发用于缩短PCR扩增时间。以常规10 μL PCR扩增体系进行说明：①DNA聚合酶的活性，即扩增速率与效率，需要高保真DNA聚合酶，由于酶要混合于Master Mix中，因此还要取决于酶的浓度；②Master Mix，包含Mg2+、dNTP、10×PCR Buffer，以及这些组分的浓度；③热循环参数，一般包括预变性、变性、退火、延伸、最后延伸，退火温度在59～61 ℃之间较为合适[18-19]，同时还可以省去延伸环节，根据情况设置不同的DNA模板量和PCR循环数进行平行扩增，以求获得成功的STR分型；④热循环仪，扩增时间的长短主要取决于热循环仪的升降温速率与热传递效率，升降温速率快、温控性能好的快速PCR仪，如AB 9700金制模块扩增仪的max升降温模式；Eppendorf Mastercycler pro S银制模块扩增仪[19]，其升降温速率分别为：6 ℃·s-1和4.5 ℃·s-1；AB Veriti扩增仪时，升温模式选择100%。

2.5 电泳检测及分型分析

毛细管电泳检测的改变主要体现在提高进样电压延长进样时间以及PCR产物脱盐处理方面。有研究比较了28个循环数的PCR产物脱盐处理、改善毛细管电泳检测电压和时间、34个循环数的PCR扩增在痕量法医检材上的应用，结论是28个循环数的PCR产物脱盐处理优于其它方法[20]。由于微量生物检材得到的模板DNA量有限，因此充分利用PCR扩增产物显得尤为重要，PCR产物脱盐处理主要有凝胶、过滤、纯化等[21]。PCR产物纯化之前，在恒定的电压下和一定的进样时间，DNA同时要和内标及PCR产物的其它组分竞争性进入毛细管，如果DNA被电泳检测的量少，就会影响到STR分型成功率。脱盐纯化后的PCR产物，纯度更高，进入毛细管的扩增产物就增多，电泳检测的STR峰型强度也高，大大地降低了背景干扰，使结果判读清晰可见。

在法医DNA检验领域中，最终电泳数据的核查分析，一般采用GeneMapper系列软件(如GeneMapperID-X)进行分析，但为了防止引物设计不同而使分析软件错误分型，先用一种软件(如GeneMarkerTMHID或IDproof)分析[22]，再用另外一种软件(如GeneMapperID-X)复核分析。GeneMarkerTMHID或IDproof Mixture Software是一款功能强大的STR分析工具，包含批量处理数据、生成质量报告、显示电泳图、STR分型分析等基础功能，还可以进行混合斑的个体识别、DNA数据的同一性比对等DNA分型结果的生物统计学计算和结果解释。

当前的STR分型技术从样本DNA的提取到最后得到分型结果都需要在实验室中分步完成，而且还要确保样本转移过程中不受污染，这都是耗时费力的工作。为解决这一问题，需要有快速便携的DNA分型装置在现场实时进行样本的分析处理，将DNA分析的很多步骤微化集成到微芯片上，包括DNA提取、PCR扩增和毛细管电泳分离，这些技术也已经开始应用到法医中，也就是基于微流控芯片(MOVeTM)技术的一次性试剂盒，可以避免检验者干预、检材污染和样品残留风险。快速DNA分析是发展的趋势，微流控芯片技术是发展的重点，两者的结合将是法医遗传领域研究的前沿热点。目前，微流控芯片技术在法医DNA分析中的应用逐渐成熟，虽然现有的方法还有不足之处，但将来基于微流控芯片技术的DNA分析方法将会以其体积小、速度快、灵敏度高等优点在犯罪现场的实时分析中发挥重要作用。

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Rapid DNA Fingerprint Technology for Individual Identification

LIU Ya-ju, YUE Jun-tao

(Institute of Criminal Science and Technology,Xuchang Public Security Bureau,Xuchang 461000,China)

ObjectiveTo explore the potential of rapid DNA fingerprint technology for forensic individual identification combined with the practical cases.MethodsThe rapid STR amplification kit and the on-site integrated DNA testing equipment were illustrated respectively. Sampling implement, sample processing, amplification reagents, optimization of distribution ratio, electrophoresis detection and data analysis were listed for the influence of rapid detect method.ResultsThe high quality and concordant STR profile were both attained and the protocols could meet the need of conventional laboratory testing.ConclusionThe rapid DNA fingerprint technology could be used for forensic individual identification, which would have important significance for DNA extraction and identification from the crime scene.

forensic genetics；rapid DNA fingerprint analysis；STR technology；individual identification

1672-688X(2016)04-0294-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.017

2015-10-09

许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南许昌 461000

刘亚举(1978-)，男，河南襄城人，副主任法医师，从事DNA检验及法医遗传学统计工作。

DF795.2

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