槐定碱对人胰腺癌细胞株capan-1增殖及侵袭能力的影响

任丽平，李先佳，金少举

槐定碱对人胰腺癌细胞株capan-1增殖及侵袭能力的影响

任丽平，李先佳，金少举

目的 探讨槐定碱对人胰腺癌细胞株capan-1增殖和侵袭能力的影响。方法 用MTT法检测不同浓度的槐定碱对capan-1细胞增殖的影响，Transwll实验检测槐定碱对capan-1细胞侵袭能力的影响，ELISA实验检测MMP-2和 MMP-9表达水平。结果 不同浓度的槐定碱均能明显抑制capan-1细胞生长(P<0.05)；与空白对照组比较，槐定碱1.25、2.5、5 g·L-1组capan-1细胞MMP-2和MMP-9表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 槐定碱能通过下调MMPs的表达水平，有效地抑制capan-1细胞增殖，降低细胞侵袭能力。

胰腺癌；capan-1；槐定碱

胰腺癌起病隐匿、恶性程度高，具有生存率低、病死率高等特点，发病率呈逐年上升趋势。该病的治疗除传统的手术治疗外，药物治疗一直是研究热点。槐定碱是从中药苦豆子中提取的生物碱之一[1]，具有抗心律失常、保护心肌、抗菌、抗病毒及镇痛等作用，对绒癌、恶性葡萄胎等恶性滋养细胞肿瘤具有较好的抑制作用[2]，对癌细胞具有直接杀伤作用，且毒性较低[3]，但其作用机制目前并不明确。基质金属蛋白酶类(matrix metalloprotein,MMP)为一种常见的锌离子依赖性内肽酶，能降解细胞外基质和促进血管的生成，可为癌细胞侵袭转移提供必要条件[4]。其中MMP-2、MMP-9为MMP中常见的酶，与肿瘤细胞的侵袭及转移关系密切[5]。本研究通过观察MMP-2、MMP-9表达的变化，探讨槐定碱抑制人胰腺癌细胞株capan-1增殖和侵袭力的可能作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 capan-1细胞株由漯河医专分子生物学实验室传代保种。槐定碱为宁夏盐池县医药公司提供(批号：060630，纯度>99%)，用培养基稀释成不同浓度，过滤除菌4 ℃保存。胎牛血清(杭州四季青生物技术公司，批号：140130)，56 ℃灭活30 min，-20 ℃保存备用)；0.25%胰酶(美国Gibco公司，批号：22250-018)；二甲亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(无锡海硕生物有限公司)，四甲基偶氮唑盐MTT(美国Sigma公司，批号：M2128)；DMEM培养基(Dulbeco’s modified eagle medium, DMEM)(美国Hyclone公司，批号：NAE1396)；MMP-2(编号：MMP200) 和MMP-9(编号：DMP900)ELISA 试剂盒(美国R&D Systems公司)；Transwell小室购于美国Corning公司。TE2000型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；ST-360酶标仪(上海科华实验系统有限公司)。

1.2 细胞培养 capan-1细胞株由漯河医专分子生物学实验室传代保种，用含10%胎牛血清的 DMEM 培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养，用 0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化。

1.3 方法

1.3.1 MTT法测定槐定碱对人胰腺癌细胞株capan-1细胞增殖的影响 取对数期capan-1细胞，细胞浓度调整至5×104个·mL-1，取100 μL接种于96孔板，贴壁后24 h去上清，分别加入含10、5、2.5、1.25、0.625、0.308、0.154 g·L-1的槐定碱溶液100 μL，对照组给予等量培养液，空白对照组不含细胞只加等量的培养液；每组3个复孔；37 ℃、5% CO2条件下分别培养24、48以及72 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，4 h后吸去培养液，每孔加入DMSO 200 μL，震荡10 min，在酶标仪上读取570 nm处的吸光度(A)值，检测重复4次，计算抑制率及半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

1.3.2 槐定碱对capan-1细胞侵袭力的影响 取出-20 ℃保存的Matrigel基质胶，4 ℃过夜，置于冰上，用无FBS培养基9∶1稀释基质胶。24孔Transwell小室每孔加入20 μL基质胶溶液，37 ℃孵育30 min，使Matrigel聚合成胶。将各组细胞调整细胞浓度为2×105·mL-1。在Transwell小室下室内加入500 μL含20% FBS的完全培养基，置入铺过基质胶的Transwell小室，上室内加入200 μL细胞悬液，常规培养24 h。取出小室，弃培养基，4%甲醛固定5 min，结晶紫染色30 min。流水冲洗小室，酒精棉签小心擦去基质胶和细胞，快速风干。倒置小室，显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞，重复3次。

1.3.3 槐定碱对MMP-2及MMP-9的影响 用稀释液将标准品等比稀释绘制标准曲线，先加稀释液40 μL到包被反应孔中，再加入待检测样品10 μL，置37 ℃孵育1 h，然后洗涤。于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体50 μL(空白孔不加)。37 ℃孵育0.5 h，洗涤。加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B，避光显色20 min。于各反应孔中加入2 M硫酸50 μL。在ELISA检测仪上，于450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔吸光度OD值，然后根据标准曲线计算MMP-2及MMP-9的浓度。

2 结果

2.1 MTT法测定槐定碱对capan-1细胞增殖的抑制作用 不同浓度的槐定碱对胰腺癌细胞株capan-1的增长均具有不同程度的抑制增殖作用，呈时间和剂量效应关系，见图1。根据生长抑制率采用综合法计算24、48和72 h半数抑制量值，分别为5.93、3.82、2.834 g·L-1。

图1 槐定碱对capan-1细胞增殖的抑制作用

2.2 Transwell实验测定槐定碱对capan-1细胞侵袭力的影响 用不同浓度1.25、2.5、5 g·L-1的槐定碱干预48 h后，在显微镜(×200)下每孔随机选择5个视野计数细胞，各组细胞的穿膜细胞数分别为(25.27±1.53)、(19.42±1.71)和(15.44±2.28)个，分别与空白对照组穿膜细胞数(37.32±3.05)个比较槐定碱组capan-1细胞透膜细胞数明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，呈剂量效应关系，见图2。

A：空白对照组 B、C、D：分别代表槐定碱1.25、2.5、5 g·L-1组图2 槐定碱作用capan-1细胞侵袭实验结果(×200)

2.3 ELISA法测定各组细胞MMP-2及MMP-9表达量 与空白对照组比较，槐定碱1.25、2.5、5 g·L-1组capan-1细胞内MMP-2及MMP-9表达水平较明显下降(P<0.05)，呈剂量效应关系，见图3。

A：各组MMP-2表达量;B：各组MMP-2表达量。 ①与空白组比较，P<0.05。图3 ELISA检测MMP2及MMP-9含量

3 讨论

多项研究表明槐定碱对恶性肿瘤有治疗作用。首先，槐定碱有诱导凋亡作用，李明潺等[6]发现槐定碱通过激活caspase-3/8途径诱导肺癌A549细胞凋亡，韩靓等[7]研究发现槐定碱能显著抑制人胃癌细胞株SGC7901细胞增殖。其次，槐定碱可以抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，赵树鹏等[8]研究发现槐定碱通过NF-κB信号通路和激活凋亡caspase-3酶联反应信号通路抑制神经胶质瘤U87细胞的侵袭、MMP-2的分泌及抑制肿瘤细胞的增殖。研究表明基质金属蛋白酶类(matrix metalloprotnases, MMPs)是重要的蛋白水解酶，与癌细胞侵袭转移密切相关[9]。

本研究中不同浓度的槐定碱组对capan-1细胞有明显的生长抑制作用，不同浓度的槐定碱能明显抑制capan-1细胞的增长，并具有浓度和时间的依赖性，尤其5 g·L-1浓度抑制效果尤其明显，提示槐定碱能显著抑制capan-1细胞的生长。MMP-2和MMP-9均为MMPs中常见基质金属酶，能降解细胞外基质，破坏细胞基底膜的连续性和完整性，与胰腺癌[10]、肝癌[11]等癌细胞的侵袭转移能力以及浸润密切相关。本研究显示不同浓度的槐定碱加入capan-1细胞培养液中48 h后，结果显示槐定碱能在一定程度下调MMP-2和MMP-9水平，而且槐定碱水平越高，MMP-2和MMP-9水平越低，上述结果与槐定碱对其他肿瘤侵袭的影响研究一致[8]。这也提示槐定碱能有效抑制capan-1细胞的增殖及侵袭能力，其具体作用机制还需要进一步研究。

总之，槐定碱能有效抑制capan-1细胞的增殖和侵袭能力，通过协调MMPs的表达水平拮抗胰腺癌的侵袭，对其进一步研究，可为胰腺癌的靶向治疗提供新的方法。

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[5] 王曼,朱振红,朱正秋,等.MACC1调节肝星状细胞表达MMP-2、MMP-9对胃癌细胞迁移侵袭能力的影响[J].胃肠病学和肝病学杂志,2016,25(7):765-768.

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[8] 赵树鹏,靳彩玲,高国军,等.槐定碱对神经胶质瘤U87细胞增殖、侵袭及相关信号通路的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2016,23(3):360-365.

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Sophoridine Effect on the Proliferation and Invasiveness of Human Pancreatic Cancer Capan-1 Cells Lines

REN Li-ping, LI Xian-jia, JIN Shao-ju

(Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

ObjectiveTo explore the effect of Sophoridine on proliferation and invasiveness of human pancreatic cancer capan-1 cells lines.MethodsMTT was used to detect the effcct of Sophoridine with different concentration on the proliferation of capan-1 cells. Transwll assay detected the effect of Sophoridine on the invasiveness of capan-1 cells, and ELISA assay detected expression level of MMP-2 and MMP-9.ResultsCompared with control group, different concentration of Sophoridine could inhibit growth of capan-1 cells significantly (P<0.05).The expression level of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated for the group with the dosage of 1.25, 2.5, 5 g·L-1Sophoridine, respectively (P<0.05).ConclusionSophoridine could decrease MMPs expression level, inhibit cell proliferation of capan-1, and reduce the cell invasiveness of capan-1.

pancreatic cancer；capan-1 cells；Sophoridine

1672-688X(2016)04-0244-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.002

1.河南省高等学校重点科研资助项目(16B310004) 2.漯河医学高等专科学校2016年度校级研究资助计划项目(2016-S-LMC-13)

2016-10-07

漯河医学高等专科学校，河南漯河 462002

任丽平(1984-)，女，河南舞阳人，讲师，从事肿瘤药理学研究。

金少举，男，博士，副教授，Email：37050573@qq.com

R285.5;R735.9

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