MRI联合荧光原位杂交技术在尿路上皮癌术后复发监测中的应用分析

吴钉 郭永连 李国灏

·临床研究·

MRI联合荧光原位杂交技术在尿路上皮癌术后复发监测中的应用分析

吴钉 郭永连 李国灏

目的 评价MRI联合荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridzation, FISH)和FISH、膀胱镜检查在尿路上皮癌术后复发监测中的应用，为完善尿路上皮癌术后复发监测提供理论依据。 方法 选取2013年1月至2015年1月60例临床诊断的高危膀胱尿路上皮癌患者，术后第3、6、9、12和18个月随访均行FISH、FISH联合MRI检查及膀胱镜加活组织检查。 结果 60例入围患者的监测，单纯采用FISH检查，阳性33例，疑似肿瘤复发占55.0%；MRI加FISH检查，阳性累计36例，疑似肿瘤复发占60.0%。所有疑似病例均采用膀胱镜加活组织检查，最终确认肿瘤复发患者35例，占全部患者的58.3%，其中单纯采用FISH检查发现肿瘤复发27例，占肿瘤复发患者的77.1%;而采用MRI联合FISH检查发现肿瘤复发累计达32例，占肿瘤复发患者的91.4%。 结论 MRI联合FISH对膀胱肿瘤检测的阳性率高于单用FISH检测，MRI联合FISH可能成为一种新的早期诊断和监测膀胱癌术后复发的有效方法。

尿路上皮癌； 荧光原位杂交技术； 复发； 磁共振成像

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。初发膀胱癌中75%以上为非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌，可行经尿道膀胱肿瘤切除术，术后辅以膀胱灌注治疗，但其术后复发率较高，需长期随访监测[1]。传统的尿脱落细胞学检查的敏感性较低，而膀胱镜检为有创检查，患者大多难以接受[2]。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridzation, FISH)作为快速、敏感的一种检测方法，它主要利用标记荧光的探针与目标染色体或基因片段结合，再通过荧光显微镜观察来确定细胞内染色体结构和数目的异常。MRI检查是无创的过程，目前被普遍用于膀胱肿瘤分期的诊断。本研究采用MRI联合FISH检测诊断尿路上皮癌，并与单纯采用FISH检测作对比，以膀胱镜加活组织检查最终确诊，探讨MRI联合FISH在预测膀胱癌术后复发监测中的作用。

对象与方法

一、临床资料

入围标准：术前相关检查初步诊断为膀胱占位，并在我科行经尿道膀胱肿瘤电切术，术后病理证实为膀胱尿路上皮癌者(肿瘤临床分期[3]≤T1期，即浅表性膀胱癌，膀胱鳞癌、腺癌等非尿路上皮癌需除外)；高危非肌层浸润膀胱癌符合以下任何一项条件：T1期肿瘤，G3(高级别)肿瘤，原位癌，同时符合多发、复发和直径>3 cm的Ta低级别(G1～2)肿瘤；术后第3个月行膀胱镜检查未见明确肿瘤复发者。2013年1月至2015年1月，符合入围标准的患者共60例，其中男43例，女17例；年龄36～75岁，平均54岁。60例患者膀胱肿瘤电切标本分层送病检，病理分期[3]为原位癌期9例(仅侵犯黏膜层，未侵犯黏膜下层)、Ta期22例、T1期29例；高级别尿路上皮癌24例、低级别尿路上皮癌36例。本研究项目通过我院伦理委员会审核批准，参与研究的患者均签署相关知情同意书。

二、检测方法

1.MRI灌注成像：扫描前0.5 h嘱咐患者饮水至膀胱充满尿液。使用Philips公司Achieva 3.0 T超导型磁共振扫描仪，采用6通道体相控阵线圈和敏感度编码扫描技术，取仰卧位，扫描范围从膀胱顶至膀胱底。

2.FISH检测：收集60例患者的新鲜晨尿200～400 ml，按以下步骤检测。取晨尿200～400 ml，分装入50 ml离心管后，2 000 r/min离心10 min，去上清后收集细胞，然后加5 ml胶原酶B，用力吹打悬浮细胞后37 ℃水浴20 min，期间吹打2～3次。1 200 r/min离心10 min去上清后，加入37 ℃预热的0.075 mmol/L的氯化钾低渗液5 ml，重新轻轻吹打悬浮细胞后，37 ℃水浴30 min，期间吹打一次。低渗后加入2 ml固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，吹打均匀，预固定10 min，1 000 r/min离心10 min后弃上清。加固定液5 ml于试管中，吹打均匀后，1 000 r/min离心10 min，弃上清，此固定过程再重复2次。探针杂交：取适量悬浊液滴于干燥玻片上，自然晾干后，观察细胞密度，以10倍镜下每视野30～50个为宜。将玻片放入37 ℃ 20 g/L胃蛋白酶工作液40 μl消化10 min。室温下将玻片依次放入70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中脱水各2 min，取出玻片，自然晾干。将探针混合物10 μl加入玻片杂交区域，加盖玻片，用封片胶封闭边缘，80 ℃ 6 min共变性，42 ℃过夜杂交。

FISH阳性判断：正常细胞的CSP3、CSP7、CSP17号探针及GLPp16位点为二倍体，细胞核中分别可以见到2个绿色以及2个红色信号。如果细胞中出现不同于上述二倍体的非二倍体改变，即为异常表现。两组或两组以上探针阳性[指标阳性：检测指标值p16(1)≥15%；p16(2)≥15%，3、7、17号染色体非整倍体异常率≥10%]即判读为FISH阳性；9p16基因缺失阳性，也判读为FISH阳性。

3.膀胱镜检查：术后每3个月复查，采用Olympus软膀胱镜进行膀胱镜检查，疑似肿瘤复发者取活组织病检。

三、统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计数资料用例数和百分数表示，配对数据组间比较采用McNemar’s检验。以膀胱镜检查为金标准，计算MRI联合FISH和FISH的诊断敏感度、特异性，并进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

60例高危膀胱尿路上皮癌患者在行经尿道膀胱肿瘤电切术后随访3～18个月，均以膀胱镜检查确诊有无复发。60例患者的监测，单纯采用FISH检查，阳性33例，疑似肿瘤复发占55.0%；MRI加FISH检查，阳性累计36例，疑似肿瘤复发占60.0%。所有疑似病例均采用膀胱镜加活组织检查，最终确认肿瘤复发患者35例，占全部患者的58.3%，其中单纯采用FISH检查发现肿瘤复发27例，占肿瘤复发患者的77.1%；而采用MRI联合FISH检查发现肿瘤复发患者累计达32例，占肿瘤复发患者的91.4%。35例膀胱肿瘤复发患者中，有7例患者最初尿FISH检测阳性而膀胱镜检查阴性。60例高危膀胱尿路上皮癌患者中无肿瘤复发者25例(41.6%)，其中FISH阳性6例(24.0%)，FISH阴性19例(76.0%)。60例患者MRI联合FISH分析及单纯FISH检测结果见表1。

表1 MRI联合FISH及单纯FISH检测结果(例)

分别统计两种检查方法的敏感度、特异性、误诊率、漏诊率、阳性预测值、阴性预测值和准确率，并进行比较，见表2。MRI联合FISH和FISH诊断的准确率分别为88.3%、76.6%，而MRI联合FISH诊断的敏感度和特异性均高于FISH。总体而言，91.4%(32/35)的MRI联合FISH诊断阳性者膀胱肿瘤复发，阴性者3例出现膀胱肿瘤复发。MRI联合FISH诊断膀胱尿路上皮癌复发率高于单纯FISH检测(32/35 vs 27/35，P<0.05)。7例肿瘤复发患者MRI联合FISH阳性先于膀胱镜检查及FISH检查。

表2 MRI联合FISH及FISH检测的比较

与FISH检测比较*P<0.05

讨 论

目前，尿脱落细胞学检查与膀胱镜检查是膀胱尿路上皮癌术后的主要随访项目，但尿脱落细胞学检查的敏感度不高[4]。MRI和FISH均为无创检查，MRI联合FISH对于检测膀胱尿路上皮癌具有较高的敏感度和特异性，从一定程度上减少了膀胱镜检查的使用[5]。MRI检查呈多序列、多方位成像，能准确显示肿瘤的大小、形态、部位、组织结构及肿瘤与周围组织的关系，对肿瘤定位、定性诊断及膀胱癌临床分期有很大帮助。但是MRI对于<1 cm的原位癌难以显示[6]，Dodurga等[7]发现FISH具有略优于细胞学的效果，且其敏感度随着膀胱肿瘤分级而提高。因此，MRI联合FISH有利于早期发现膀胱肿瘤。

我们前期研究[8]表明，3号、7号、17号染色体非整倍体的改变及p16位点的异常和膀胱尿路上皮肿瘤存在密切关系。本研究结果进一步显示，MRI联合FISH检测膀胱尿路上皮肿瘤术后复发的敏感度高于单纯采用FISH检查(91.4% vs 77.1%，P<0.05)。

在FISH预测膀胱癌术后复发方面，Sarosdy等[9]对膀胱镜检查阴性而MRI联合FISH检查呈阳性患者的随访中发现，FISH阳性患者最终确诊为膀胱癌的比例较高。Yoder等[10]对膀胱癌术后患者进行连续29个月的随访发现，膀胱镜检查阴性而尿FISH检测呈阳性的患者，膀胱癌复发率高达65%。本研究对60例膀胱肿瘤术后患者进行连续18个月的随访观察发现，35例膀胱肿瘤复发患者中有7例最初尿FISH检测阳性而膀胱镜检查阴性。本研究结果显示MRI联合FISH对膀胱肿瘤检测的阳性率高于单用FISH，且诊断早于膀胱镜和单用FISH。MRI联合FISH将为膀胱癌术后复发监测提供一种简便、快捷、有效的方法，可为患者的预后提供参考。

[1] 那彦群,叶章群,孙颖浩,等. 中国泌尿外科疾病诊断治疗指南[M]. 北京:人民卫生出版社,2014:20-60.

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[4] 王南雄,王尉,吕军,等. 多色荧光原位杂交技术在尿脱落细胞学阴性膀胱癌患者术后随访监测中的应用[J]. 山东医药,2015,55(17):7-9.

[5] Ke Z, Lai Y, Ma X, et al. Diagnosis of bladder cancer from the voided urine specimens using multi-target fluorescence in situ hybridization[J]. Oncol Lett,2014,7(2):325-330.

[6] 谷现恩. 膀胱肿瘤的影像学诊断[J]. 中国临床医生,2002,30(2):3-5.

[7] Dodurga Y, Avci CB, Yilmaz S, et al. UroVysion fluorescence in situ hybridization (UroVysion FISH) assay for detection of bladder cancer in voided urine of Turkish patients: a preliminary study[J]. Contemp Oncol (Pozn),2013,17(2):156-160.

[8] 吴钉,郭永连,袁静萍,等. 荧光原位杂交技术在血尿待诊病因诊断中的临床应用分析[J]. 临床泌尿外科杂志,2015,30(7):625-627,630.

[9] Sarosdy MF, Schellhammer P, Bokinsky G, et al. Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer[J]. J Urol,2002,168(5):1950-1954.

[10] Yoder BJ, Skacel M, Hedgepeth R, et al. Reflex UroVysion testing of bladder cancer surveillance patients with equivocal or negative urine cytology: a prospective study with focus on the natural history of anticipatory positive findings[J]. Am J Clin Pathol,2007,127(2):295-301.

(本文编辑：熊钰芬)

The application analysis of MRI and fluoresence in situ hybridization in the etiological diagnosis postoperative recurrence of bladder urothelial cancer

WUDing,GUOYong-lian,LIGuo-hao.

DepartmentofUrology,theCentralHospitalofWuhan,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China

LIGuo-hao,E-mail:41504101@qq.com

Objective To evaluate the clinical utility of MRI combined with fluorescence in situ hybridization (FISH) assay as a non-invasive molecular test, meanwhile to provide the theoretical basis for establishing or improving surveillance of postoperative recurrence of bladder urothelial cancer. Methods Sixty patients diagnosed with bladder urothelial cancer were chosen between January 2013 and January 2015. FISH, FISH combined with MRI and cystoscopy with biopsy were performed in these patients at 3, 6, 9, 12, and 18 months post-operation, and tumor recurrence was recorded. Results Among the 60 patients tested, FISH-positive patients were 33 cases, of which suspected tumor recurrence accounted for 55.0%. MRI and FISH positive patients were a total of 36 positive cases, of which suspected tumor recurrence accounted for 60.0%. All suspected cases were treated with bladder cancer with cystoscopy and biopsy. Finally 35 cases of patients were confirmed with tumor recurrence. Pure FISH findings of tumor recurrence were 27 cases, accounting for 77.1% of the patients with tumor recurrence. However, MRI combined with FISH examination were a total of 32 cases tumor recurrence in patients, accounting for 91.4% of the patients with tumor recurrence. Conclusions The positive rate of MRI combined with FISH for the detection of bladder cancer is higher than that of FISH, MRI and FISH may become a new method for early diagnosis and monitoring of postoperative recurrence of bladder cancer.

Urothelial carcinoma; Fluoresence in situ hybridization; Recurrence; Magnetic resonance imaging

武汉市卫计委科研项目(WX14C12)

430014 华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院泌尿外科

李国灏，E-mail:41504101@qq.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.06.005

2016-08-16)