豫北七猪场大肠埃希氏菌的分离及鉴定

崔迎亚,孟伟杰,唐柯,刘婷,赵坤

（河南科技学院,河南新乡453003）

豫北七猪场大肠埃希氏菌的分离及鉴定

崔迎亚,孟伟杰,唐柯,刘婷,赵坤

（河南科技学院,河南新乡453003）

从豫北地区7家规模化猪场采得疑似仔猪黄痢、白痢、水肿病病料64份,实验室共分离到大肠埃希氏菌28株,经血清学试验鉴定为O2的4株、O149的3株、O9的3株、O107的3株、O20的3株、O138的2株、O60的2株、O45的1株、O141的1株、O63的1株、O147的1株、O149的1株、O8的1株,另有2株未能定型,以O2、O149、O107、O138、O20、O60、O9等株血清型占优势.对不同分离菌株做了药物敏感性试验,为该地区猪致病性大肠埃希氏菌病治疗中药物的选择提供了依据.

仔猪大肠埃希氏菌病；分离鉴定；血清型；药敏试验

猪大肠杆菌病临床上常见的有仔猪黄痢、白痢和仔猪水肿病.仔猪黄痢常发生于7日龄内的哺乳仔猪,对仔猪成活率影响较大,危害比较严重[1-2].临床上多根据发病日龄在7日内、泄泻出黄色痢疾样粪便等特点而做出初步诊断.10～30日龄的仔猪,多发生白痢,主要症状是大便呈现乳白或灰白色.仔猪白痢发病率为10%～35%,发病率不高,但病死率非常高,在90%以上.水肿病多表现神经症状,以胃壁、肠系膜等组织水肿为特征[3].根据特征性临床症状、发病特点、病理变化,断奶的健壮仔猪突然发病、颜面肿胀、发病率低、死亡率高等即可做出诊断.确诊还需要采取前段小肠内容物分离病原性大肠埃希氏菌并鉴定其血清型方可.为搞清楚豫北地区猪源大肠埃希氏菌类型,为进一步控制本病提供理论依据,我们对该地区的猪源致病性大肠埃希氏菌进行了分离鉴定.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂及培养基营养琼脂、普通营养琼脂、营养肉汤、麦康凯琼脂平板、三糖铁琼脂平板、伊红美兰琼脂平板、糖发酵管、MR、VP培养基、药敏纸片由北京奥博星生物技术有限公司生产；大肠埃希氏菌标准O抗原血清从中国兽药监察所购得,河南科技学院预防实验室保存[4].

1.1.2 试验小鼠小白鼠由河南科技学院试验动物房饲养,20日龄小白鼠,体质量20 g左右.

1.1.3 试验病料试验病料采集于河南省豫北地区的7家养猪场病死仔猪,无菌取病死仔猪肝脏、脾脏等64份病料.

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离及鉴别培养每份病料取0.5～1.0 g,研钵内细细研磨,之后加入稀释液,1 500 r/min离心20 min,取上清液划线接种到普通琼脂平板培养基上,培养箱内37℃培养24 h,之后挑取可疑菌落进行细菌形态染色、镜检.

同时,钓取典型菌落,培养于三糖铁琼脂斜面培养基、伊红美兰琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基,进行鉴别培养,37℃培养箱内培养24 h,观察细菌菌落颜色等培养特性.

1.2.2 生化试验钓取典型菌落菌株,分别接种于蛋白胨水、糖发酵管、西蒙氏枸橼酸盐微量生化鉴定管、葡萄糖磷酸盐胨水和MR、VP培养基,放置于37℃培养箱内培养3 d.观察糖酵解情况、颜色变化等并记录结果.

1.2.3 纸片法药敏试验把分离的大肠埃希氏菌分别接种到普通肉汤培养基,增菌培养.37℃下,培养16～18 h后,稀释,含细菌量为105个/mL,稀释之后的菌液均匀涂布在普通琼脂平板培养基上,然后取各种药敏纸片,贴附在含菌琼脂平板上,置于37℃培养箱内培养24 h,之后测量抑菌圈直径大小,根据其抑菌圈直径大小可以确定菌株对药物的敏感性.判定标准是：抑菌圈直径大于15 mm者为该种抗生素高敏菌株；抑菌圈直径10～15 mm者为该种抗生素中敏菌株；抑菌圈直径小于10 mm可判定该种抗生素耐药[4-5].

1.2.4 血清型鉴定分离菌株的血清型鉴定用平板凝集试验.从麦康凯琼脂培养基上挑取各株菌落1～2个,将各菌株分别接种于营养琼脂斜面培养基,37℃培养箱内培养24 h后,用0.5%的石碳酸生理盐水2 mL洗下琼脂斜面上的细菌培养物,制成菌悬液,121℃下高压灭活2 h,制成高压抗原,先用多因子血清筛查,然后用单因子血清玻板凝集试验定型[6].

1.2.5 致病力试验选取20 g左右的小白鼠为对象.每组接种6只,用营养肉汤37℃下培养16～18 h后的纯化菌株培养液,分别进行腹腔接种,每只腹腔注射接种0.3 mL.6只小白鼠接种无菌肉汤作为对照组.观察统计注射后小白鼠发病、死亡情况,并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌[6].

2 结果与分析

2.1 培养特性

分离菌株在营养琼脂培养基上37℃培养箱内培养24 h后,可见圆形、较湿润、隆起的灰白色中等大小菌落[7].在营养肉汤中经37℃培养箱内16～18 h培养后,可见在肉汤内有均匀一致的混浊物,在试管底部有灰白色沉淀物,液面管壁处可见菌环形成；培养物经涂片、革兰氏染色之后镜检,视野下可见到大多数是单个存在的两端钝圆、革兰氏阴性粗短杆菌.在麦康凯琼脂、三糖铁等鉴别培养基上的生长特性列于表1.这些特性均符合典型大肠埃希氏菌的形态特征和培养特性[7].

表1 鉴别培养结果Tab.1 The results of identification culture

2.2生化试验

分离菌株可以分解葡萄糖,且产酸、产气.能发酵山梨醇、甘露醇.多数菌株能发酵水杨素[5-7].乳糖能被大多数菌株分解,只有个别菌株出现迟缓发酵乳糖,或者不规则发酵乳糖.对赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸,大多数菌株具有脱羧能力.V-P试验判定为阴性.靛基质试验产生红色环状物,判定为阳性.M-R试验指示剂变红,判定为阳性.硫化氢实验中培养基不变色,判定为阴性.尿素酶试验培养基不变色,判定为阴性.具体情况列于表2.

表2 致病性大肠埃希氏菌的生化试验结果Tab.2 Biochemical experiment results of Escherichia coli

依据前面所进行的各项试验结果可以判定,所分离菌株为大肠埃希氏菌.

2.3 致病性试验

在腹腔接种分离菌株8 h后,可见试验组小白鼠开始陆续发病,继而死亡,接种菌株72 h内,所有参试小白鼠全部死亡.而对照组的6只小白鼠隔离饲养7 d无一例死亡.无菌取死亡小白鼠肝、脾,按照本文所述的细菌分离培养方法,接种鉴别培养基麦康凯琼脂培养基上,培养箱内37℃培养24 h后,出现典型红色菌落,分离菌株进行染色、镜检,其形态特征符合大肠埃希氏菌的特点.说明从病死仔猪中分离的大肠埃希氏菌具有致病性.

2.4 药敏试验

药敏试验结果列于表3.

表3 28株大肠埃希氏菌对抗生素敏感性试验结果Tab.3 Drug sensitivity test results of Escherichia coli to different antibiotics%

（续表3）

由表3可以看出,28株大肠埃希氏菌对庆大霉素、氧氟沙星、环丙沙星最为敏感,敏感率超过50%[8].而对乙酰螺旋霉素、苯唑青霉素、头孢唑林、青霉素、头孢氨苄、强力霉素、磺胺甲基异恶唑等药物敏感率较低,耐药率居高不下（均大于80%）.

2.5 血清型鉴定结果

从64份病料中共分离出大肠埃希氏菌28株,经O抗原玻板凝集试验检测,其O抗原血清型包括：O2的4株、O149的3株、O107的3株、O138的2株、O20的3株、O60的2株、O9的3株、O45的1株、O63的1株、O141的1株、O149的1株、O147的1株、O8的1株,另有2株未能定型,而以O2、O149、O107、O20、O9等菌株血清型占优势.

28株大肠埃希氏菌经O抗原单因子血清检测,鉴定出共有13种血清型存在,而以O2、O149、O107、O20、O9株血清型占优势.

3 小结

28株大肠埃希氏菌经O抗原单因子血清检测,鉴定出共有13种血清型存在,而以O2、O149、O107、O20、O9株血清型占优势.

大多数菌株具有多重耐药性.本研究发现,最少耐药4种,最多达到20种.本地菌株对庆大霉素敏感率最高（52.40%）,其次为氧氟沙星（51.74%）和环丙沙星（50.97%）.敏感率最高者也仅仅超过50%,说明耐药菌株较多,必将给防治工作带来较大困难.从耐药情况来看,对乙酰螺旋霉素耐药率最高,达100%,其次是苯唑青霉素95.24%、头孢唑林91.96%、青霉素85.72%、头孢氨苄84.82%、强力霉素84.13%和磺胺甲基异恶唑82.52%,这也符合革兰氏阴性菌株对抗生素耐药的规律.

[1]李运龙,李继伟,任家琰.仔猪大肠埃希氏菌杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].甘肃畜牧兽医,2009（2）：4-7.

[2]李冰,唐峰,马鸣潇.锦州地区鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国农学通报,2011,27（29）：38-41.

[3]薛雨佳,于大勇,崔敏,等.引发仔猪水样腹泻的多重耐药、高致病性大肠埃希菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2013,40（9）：204-208.

[4]汪洋,易力,王红宁,等.川西北牦牛致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国兽医杂志,2008,44（5）：36-37.

[5]杨山虹,刘琪,梁培松,等.2007—2010年临床分离大肠埃希菌药物敏感性分析[J].中国病原生物学杂志,2012（6）：467-468.

[6]蔡葵蒸,靳国琴,柴君秀,等.仔猪大肠杆菌性腹泻的调查及病原特性的研究[J].动物医学进展,2002,23（5）：101-103.

[7]赵坤,王三虎,高杰.豫北地区猪源致病性大肠杆菌分离与鉴定[J].河南科技学院学报,2007,35（3）：25-27.

[8]毕艳铎,魏晓曼,冉旭华,等.猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析[J].黑龙江八一农垦大学学报, 2015,26（6）：28-32.

（责任编辑：卢奇）

Isolation and identification of Escherichia coli from seven swine farms in the north of Henan

CUI Yingya,MENG Weijie,TANG Ke,LIU Ting,ZHAO Kun
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Twenty-eight strains of Escherichia coli were isolated from seven swine farms in the north of Henan,and were identified by serologic test as four O2,three O149,three O9,three O107,three O20,two O138,two O60,one O45,one O141,one O63,one O147,one O149,one O8,and two uncertained.O2,O149,O107,O138,O20,O60,and O9were superior main.Drug sensitivity of different strains was tested,which can provide evidence for the choose of drug to the E.coli in this region.

Escherichia coli；isolation and identification；serogroups；drug sensitivity test

S852.61

A

1008-7516（2016）02-0045-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.02.011

2016-02-29

2012年地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（201210467013）

崔迎亚（1990―）,河南夏邑人,本科生.

赵坤（1968―）,男,河南南阳人,博士,教授.主要从事动物传染病学教学与研究工作.