翼蓼块根的抗氧化活性和抑制癌细胞增殖的研究

许明录,左浩,汪高博,高岩,袁晓芳,李柳燕,郭理想,朱雪雪

（河南科技学院,河南新乡453003）

翼蓼块根的抗氧化活性和抑制癌细胞增殖的研究

许明录,左浩,汪高博,高岩,袁晓芳,李柳燕,郭理想,朱雪雪

（河南科技学院,河南新乡453003）

对翼蓼块根的体积分数90%乙醇提取物及其不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性和抑制MCF-7癌细胞增殖作用进行研究.结果表明：乙酸乙酯层萃取物的总酚和黄酮高达211.99 mg没食子酸/g和21.50 mg槲皮素/g,其DPPH自由基清除能力的EC50值为14.08 μg/mL.测定还原能力结果表明乙酸乙酯层萃取物层质量浓度为1 000 μg/mL时,吸光度为1.09.乙酸乙酯层萃取物质量浓度为2 mg/mL时,MCF-7癌细胞增殖抑制率达97.15%.

翼蓼；总酚；总黄酮；DPPH；MCF-7癌细胞

翼蓼（Pteroxygonum giraldii Dammer et Diels）是我国特有的一种多年生草本植物[1],其块根俗称“荞麦七”.产于河北、山西、河南、陕西、甘肃、湖北及四川.生山坡石缝,山谷灌丛,海拔600～2 000 m.有研究表明,蓼科植物具有抗肿瘤、抗氧化、降血压、抑制α-葡萄糖苷酶、调节血脂等生理活性,其化学成分主要是含挥发油、黄酮类、蒽醌类、萜类及芪类等的化合物[2].

抗氧化剂不仅可以防止由空气氧化引起的食物腐败,而且可消除人体有氧代谢中产生的内源性活性自由基,阻断过多自由基对人体细胞膜及大分子（如蛋白质、DNA）的损伤,防止炎症及恶性肿瘤的发生.现已证明,这些有毒物质对人体的损害大多是通过自由基起作用,而抗氧化剂治疗是有效的方法.有研究表明,黄酮类化合物具有不容忽视的抗氧化能力[3-5].癌症是严重威胁人类健康的恶性肿瘤,有研究表明,翼蓼块根提取物对A549肺癌细胞有明显的抑制作用[6].

本文主要研究翼蓼块根乙醇提取物及各溶剂萃取物的总酚、总黄酮含量、DPPH自由基消除能力、羟基自由基清除能力、还原能力以及抑制MCF-7癌细胞增殖的检测.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试翼蓼块根于2010年10月采自新乡辉县市,经河南科技学院生命科技学院许桂芳教授鉴定.

正己烷（Hexane,H）、二氯甲烷（Methylene chloride,Mc）、乙酸乙酯（Ethyl acetate,EA）、正丁醇（Butanol, Bu）、无水乙醇（Ethanol,EtOH）、甲醇等分析纯试剂（天津市科密欧化学试剂有限公司）；Folin-Denis试剂（Sigma公司）；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,Sigma公司）；DMSO（二甲基亚砜）；2-脱氧核糖；FeSO4·7H2O；EDTA；AlCl3·6H2O；CH3COOK；30%H2O2；TCA溶液；TBA溶液；FeCl3；K3Fe（CN）6；磷酸盐缓冲液；MCF-7（人乳腺）癌细胞；胎牛血清；MTT（噻唑蓝）试剂；MEM培养基；胰蛋白酶-EDTA溶液等.

1.2 试验方法

1.2.1 提取过程将干燥粉碎好的翼蓼块根（3.5 kg）盛装于10 L广口瓶内,用体积分数为90%的乙醇在50℃恒温水浴锅（常州市国立试验设备研究所）中加热回流提取24 h后,用旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）将提取液浓缩蒸干,重复提取3次后得到90%EtOH提取物424.3 g.再用蒸馏水将提取物溶解,依次使用H、Mc、EA、Bu的顺序与水按1：1的比例萃取3次（见图1）后用旋转蒸发仪将萃取液浓缩蒸干,得到各萃取层和水（W）层的量：H,15.6g；Mc,3.1g；EA,29.9 g；Bu,225.4g；W,140.9g.

图1 提取与萃取流程Fig.1 The processes of extraction

1.2.2 总酚含量的测定根据许明录[7-8]等的方法略作修改,把没食子酸作为标准物用Folin-Denis试剂测定.实验组在250 μL 1 000 μg/mL试样溶液中加入500 μL Folin-Denis试剂和500 μL饱和Na2CO3溶液.空白组以超纯水代替Folin-Denis试剂,对照组以超纯水代替试样溶液和Folin-Denis试剂.充分混合后置于暗处反应1 h,然后用紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）在725 nm处测定吸光度,每个样品重复3次.以每克试样中含有没食子酸的毫克数表示总酚含量：吸光度=0.0069 mg没食子酸-0.042. 1.2.3总黄酮含量的测定在500 μL 1 000 μg/mL试样溶液中分别加入100 μL 1 mmol/L醋酸钾溶液、2.8 mL超纯水、1.5 mL体积分数95%的乙醇、1 000 μL AlCl3·6H2O（10%）溶液.对照组以超纯水代替试样溶液和AlCl3·6H2O（10%）溶液,其他条件不变.空白组以超纯水代替AlCl3·6H2O（10%）溶液,其他条件不变.混合均匀后室温下放置40 min,在415 nm下测定吸光度,每个样品重复3次.总黄酮含量以每克试样中含有槲皮素的毫克数表示：吸光度=0.006 6 mg槲皮素-0.035 7.

1.2.4 DPPH自由基清除能力的测定样品对DPPH自由基的清除能力依据王兰等[9]的方法,略作修改.本试验翼蓼块根的H、Mc、EA、Bu、W萃取物、90%EtOH提取物样品分别配置成1、5、10、25、50 μg/mL的一系列质量浓度梯度的溶液,在500 μL的各试样溶液中加入500 μL 0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液,对照组以超纯水代替试样溶液,其他条件不变.空白组以甲醇溶液代替DPPH甲醇溶液,其他条件不变.混合均匀后于室温下在暗处静置30 min,然后在517 nm处测定吸光度值,样品的每个质量浓度重复3次.待测样品对DPPH自由基的清除能力由下列公式计算,并计算出EC50值.消除率/%=[1-（Asample-Ablank）/ Acontrol]×100.

1.2.5 羟基自由基消除能力的测定将翼蓼块根的H、Mc、EA、Bu、W萃取物、90%EtOH提取物样品分别配制成一系列质量浓度梯度的溶液.试验组在小试管中依次加入100 μL FeSO4·7H2O、EDTA、2-脱氧核糖、100 μL各质量浓度的试样溶液、500 μL磷酸缓冲溶液（pH=7.4）,100 μL H2O2.对照组中将100 μL各质量浓度的试样溶液用超纯水代替,其他条件不变.于37℃水浴加热4 h.然后加入TCA溶液、TBA溶液各500 μL.将其放在100℃恒温水浴锅中加热10 min后,冷却至室温后在3 000 r/min下用离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）离心5 min.最后在532 nm处测定吸光度值,每个样品的每个质量浓度重复3次.用下列方程式计算对应待测试样下对羟基自由基的清除率.消除率/%=（1-Asample/Acontrol）×100.

1.2.6 还原能力测定将翼蓼块根的H、Mc、EA、Bu、W萃取物、90%EtOH提取物样品分别配制成一系列质量浓度梯度的溶液.移取各质量浓度的试样200 μL于试管中加入磷酸盐缓冲液（pH=6.6）500 μL,再加入1%铁氰化钾溶液500 μL在50℃下反应30 min.然后加入10%三氯乙酸溶液500 μL充分混和均匀,3 000 r/min下离心10 min.移取上清液500 μL于试管中,加入500 μL超纯水,再加入0.1%三氯化铁100 μL,常温下反应5 min.空白、对照组不加试样,加入200 μL超纯水.然后使用紫外可见分光光度计于700 nm波长下测定吸光值,每个样品的每个质量浓度重复3次.

1.2.7MCF-7癌细胞培养培养液：MEM（含2 mmol/L L-谷氨酰胺和Earle's BSS,1.5 g/L NaHCO3,0.1 mmol/L非必需氨基酸,1.0 mmol/L丙酮酸钠）+10%胎牛血清.

传代：吸去培养液.用质量分数0.25%胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA洗一次,以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）.加2～3 mL胰蛋白酶-EDTA,放在37℃培养箱内约5 min,直到细胞全部脱落.加6～8 mL培养液,用移液器把细胞吹散.加适量的细胞到新的培养器皿中.

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮.

1.2.8 MTT比色法测定抑制MCF-7癌细胞增殖能力根据邵芙蓉等[10]方法,略作修改,在不同质量浓度的各层溶液处理培养后的细胞,加MTT溶液,适量DMSO融解,酶标仪550 nm测吸光度,绘制细胞生长曲线,测定细胞存活率.从而反映抑制MCF-7癌细胞增长活性水平.

2 结果与分析

2.1 总酚和总黄酮含量

表1中翼蓼块根的体积分数为90%的乙醇提取物和5个萃取物中总酚的含量以等效物没食子酸表示,结果表明：EA层总酚含量最高,Bu层和W层含量次之,90%EtOH层含量最少；EA层总黄酮含量最高,H层和Mc层含量次之,90%EtOH层含量最少.与三七根[11]的相关研究比较：三七根中总酚和总黄酮含量最高的EA层数据分别为183.85 mg没食子酸/g样品、152.33 mg槲皮素/g样品,而翼蓼块根中总酚和总黄酮含量最高的EA层数据分别为211.99 mg没食子酸/g样品、21.50 mg槲皮素/g样品.数据说明翼蓼块根含有较多的总酚和总黄酮类化合物,可能有较好的抗氧化活性和其他生物活性.

表1 不同提取物总黄酮含量及清除DPPH自由基的EC50值Tab.1 The total phenolic contents,total flavonoid contents and the EC50values of DPPH radical scavenging activities of different solvent extracts

2.2 DPPH自由基清除能力测定结果

如表1所示,除90%EtOH层和Mc层外,其他4个萃取物的DPPH自由基清除能力的EC50值均小于50 μg/mL.样品中EA层的EC50值最小,为14.08 μg/mL,H、Bu、W层抗氧化活性能力相似,Mc层次之,而90%EtOH提取物活性最差.与其他蓼科植物DPPH自由基清除能力相关研究比较[12]：在50 μg/mL质量浓度下,大黄、厚朴、黄药子提取层的DPPH自由基清除率分别为56.40%、44.73%和52.73%,而翼蓼EA层萃取物在质量浓度为14.08 μg/mL时的DPPH自由基清除率为50%,明显高于其他同科植物.

2.3 羟基自由基消除能力的测定结果

对各样品设置了3个质量浓度梯度,见图2.

图2 不同提取物的羟基自由基清除率Fig.2 The hydroxyl radical scavenging rate of different solvent extracts

由图2可知,各样品层对羟基自由基均有清除作用,且对于同一层样品来说,随样品质量浓度增加,清除能力增强,清除率也逐渐升高.Bu层质量浓度从250μg/mL到500μg/mL时清除率急剧上升,质量浓度为1000μg/mL时,Bu层清除率最高为15.84%,其次分别为W层、H层、90%EtOH层、Mc层.EA层对羟基自由基的清除作用整体比较小,在质量浓度为250 μg/mL时,其清除率仅为0.82%.

2.4 还原能力的测定结果

对各样品设置了5个质量浓度梯度,其还原能力测定结果见图3.

图3 翼蓼块根不同提取物的还原能力Fig.3 The reducing power of different extracts of Pteroxygonum giraldii roots

由图3可以看出,翼蓼块根体积分数为90%的乙醇提取物和各萃取物的吸光度随其质量浓度增加而增大,因此其还原能力也随其质量浓度增加而增强.当EA层、Bu层样品质量浓度为1 000 μg/mL时,吸光度分别为1.09和1.07,具有较强的抗氧化活性.W层、90%EtOH层还原能力中等.而H层、Mc层还原能力相对较弱,1 000 μg/mL质量浓度下吸光度值分别为0.87和0.74.与三七根[11]的相关研究比较发现：不同质量浓度的翼蓼块根体积分数90%的乙醇提取物和各萃取物在700 nm下的吸光度值均比不同质量浓度三七根体积分数95%的乙醇提取物和各萃取物的吸光度值大,其还原能力均比三七根强.

2.5 抑制MCF-7癌细胞增殖的测定结果

对各样品设置了3个质量浓度梯度,对MCF-7癌细胞的抑制率见图4.

由图4可以看出,EA层、W层均表现出较好的抑制能力,当EA、W层样品质量浓度为2 mg/mL时,抑制率分别为97.15%与84.22%.当EA层样品质量浓度为0.5 mg/mL时,抑制率为51.87%.而Bu层抑制MCF-7癌细胞增殖能力相对较弱,2 mg/mL质量浓度下抑制率为51.57%.据相关研究[6],荞麦七水提取物与蒽醌提取物在40 mg/mL质量浓度下对A549肺癌细胞增殖的抑制率分别为88.13%和81.3%.而翼蓼块根EA层和W层在2 mg/mL质量浓度下抑制MCF-7癌细胞增殖能力均较强.

3 小结

通过数据对比发现：翼蓼块根体积分数为90%的乙醇提取物和5个萃取物的总酚和总黄酮含量与其抗氧化活性总体呈正相关,其中EA层萃取物尤为明显,其对DPPH自由基的清除作用最强,还原能力和抑制MCF-7癌细胞增殖作用对也均比其它层萃取物强,值得进一步研究并分离纯化得到活性更高的单一化合物,应用到社会生产及生活的各个领域中.

与DPPH自由基清除能力相对应的羟基自由基的清除能力却显得比较低,呈现一定程度的负相关关系.二者之间是否存在这样的关系还有待进一步研究验证.此外,本试验只针对翼蓼块根乙醇提取物进行了初步抗氧化活性及抑制癌细胞增殖作用研究,但提取物中其他成分是否也有一定程度的抗氧化活性,及不同提取方法得到的提取物抗氧化活性是否存在差异,尚需进一步研究.

目前国内外的文献对翼蓼的研究主要集中在其化学成分方面,而对其抗氧化活性和抑制癌细胞增殖的研究还比较少.本文对翼蓼块根的以上性质进行了研究,为翼蓼属植物的药用价值提供参考.

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（责任编辑：卢奇）

Antioxidant activity and Inhibition of cancer cell proliferation of differernt extracts from Pteroxygonum giraldii root

XU Minglu,ZUO Hao,WANG Gaobo,GAO Yan,YUAN Xiaofang,LI Liuyan, GUO Lixiang,ZHU Xuexue
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The 90%ethanol extract of Pteroxygonum giraldii root and its fractions of several different polar solvents were used to investigate the antioxidant activities and inhibition ability for MCF-7cancer cell proliferation in this study.The results showed that the total phenolic and flavonoid contents of the ethyl acetate fraction were high up to 211.99 mg gallic acid/g and 21.50 mg quercetin/g respectively.The ethyl acetate fraction exhibited strong DPPH free radical scavenging with the EC50of 14.08 μg/mL.Reduction ability of the ethyl acetate fraction showed that the absorbance was 1.09 at 1 000 μg/mL.The ethyl acetate fraction exhibited the 97.15%MCF-7cancer cell proliferation inhibition rate at 2 mg/mL.

Pteroxygonum giraldii；total phenolic；total flavonoid；DPPH；MCF-7cancer cell

R284

A

1008-7516（2016）02-0053-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.02.013

2016-01-11

河南科技学院大学生创新训练计划

许明录（1972―）,男,朝鲜族,吉林延边人,博士,副教授.主要从事天然药物开发及利用研究.