马齿苋类黄酮提取工艺及抑菌效果的研究

陈国妮，孙飞龙，闫亚茹

(西安工程大学环境与化学工程学院，西安 710048)



马齿苋类黄酮提取工艺及抑菌效果的研究

陈国妮，孙飞龙，闫亚茹

(西安工程大学环境与化学工程学院，西安 710048)

摘要：为了优化马齿苋类黄酮的超声波提取工艺，利用中心组合(Box-Benhnken)试验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法，用design expert软件对其提取工艺参数进行优化；并采用滤纸片法测定其对各菌的抑菌效果。结果表明：在乙醇浓度75%、超声时间35min、温度35℃时，其最佳总黄酮提取量为21.3517mg/g，与理论预测值21.8816mg/g接近，说明响应面法可用于优化马齿苋类黄酮超声波提取工艺；马齿苋类黄酮对大肠杆菌和酵母菌有较强的抑制作用，最低抑菌浓度均为0.313mg/mL，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度为 0.156mg/mL。

关键词：马齿苋；类黄酮；响应面法；提取工艺 ；抑菌效果

0引言

马齿苋(Portulaca oleracea L.)为马齿苋科一年生草本植物，药食两用。现代研究表明，马齿苋不但含有丰富的营养成分[1]，此外，相关文献记载还含有多种活性物质，包含生物碱、类黄酮(也叫黄酮类化合物)、多糖、甾醇、有机酸、苷类、酚类化合物及油脂等成分[2]。正是马齿苋所含有的这些较多的活性成分，使其具有多样的活性功能，尤其是活性成分中的类黄酮，具有较强的抗菌抑菌、抗氧化和抗癌等多种药效功能，因此有一定开发利用的必要[3]。

目前，已见报道周燕芳使用超声波法提取黄皮叶中的黄酮类化合物，结果显示与常规的浸提法相比，超声波法能缩短处理的时间[4]。但目前的类黄酮提取方法普遍存在提取效率低等的不足，同时，对于相关马齿苋类黄酮抑菌活性的研究也甚少，所以本文采取超声辅助醇提取马齿苋类黄酮的方法，并采用滤纸片法对其抑菌活性等进行研究。

本文采用超声波提取技术，运用响应面分析方法，探寻其提取马齿苋类黄酮的最佳工艺。此外，对其抗菌活性功能进行研究，以便为其应用于各种绿色食品、保健食品提供帮助，开发更安全、高效的天然食品防腐剂，提供理论基础与技术指导。

1试验材料与方法

1.1试剂与仪器

马齿苋采自西安市市郊。无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化钠均为分析纯。牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、酵母膏均为生化试剂。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌来源于陕西省微生物研究所。

DGF-1AB型立式电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；XS-04型多功能粉碎机(上海兆申科技有限公司)；752N型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；申科R-205型旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司)；SK5200LH型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；HIRAYAMA型高压蒸汽灭菌锅(浙江科通仪器有限公司)；PYX-DHS-50×65型隔水电热恒温培养箱(上海市跃进医疗有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1原料的预处理

马齿苋除去残根杂质，洗净，自然阴干后置于65℃烘箱中烘干。取出，用多功能粉碎机粉碎，过60目筛成干粉，备用。

1.2.2马齿苋类黄酮的提取与测定

(1) 马齿苋类黄酮的提取。称取马齿苋干粉1.0g放入250mL锥形瓶中，加入30mL95%乙醇，在室温下浸泡并摇匀，放到50W的超声波清洗器超声30min。用真空泵抽滤处理后的马齿苋乙醇提取液，滤液用旋转蒸发仪浓缩(温度70℃)，获得马齿苋黄酮浓缩液，密封保存[5]。

(2) 类黄酮定性检测。将提取液点于滤纸片上，置于氨水瓶口，显微黄色，移开滤纸片数分钟后，微黄色又消褪，说明该提取物中含有类黄酮存在[6]。

(3) 马齿苋总黄酮得率计算。取芦丁标准品10mg，用70%乙醇定容于10.0mL的容量瓶，配成标准溶液，进行比色测定并绘制标准曲线[7]。移取1.0mL黄酮提取液于10.0mL容量瓶中，加5% 亚硝酸钠溶液0.4mL，静置5min，10%硝酸铝溶液0.4mL，静置5min，4.2% 氢氧化钠溶液4.0mL，加蒸馏水标定至刻度，摇匀，放置15min，以不加黄酮的混合溶液作为参比，依次加入样品液，在波长510nm下测其吸光度，带入标准曲线方程，计算出总黄酮的浓度，按下式得到总黄酮提取率。测定标准品芦丁浓度C(g/L)与吸光度A所得标准曲线方程如下：

C=0.0925A+0.0002R2=0.9998

式中Y——总黄酮得率/mg·g-1

C——吸光度A时由标准曲线方程计算出样品液的质量浓度/g·L-1

V——样品液的体积/mL

m——称取样品的质量/g

1.2.3响应面法优化马齿苋中总黄酮的提取条件

在单因素试验的基础上，采用中心组合Box-Behnken设计方案[8]，设计的因素水平见表1，采用响应面法分析该3因素对自变量总黄酮得率的影响，并优化其提取条件。

表1　中心组合Box-Behnken的因素水平表

1.2.4马齿苋类黄酮抑菌性能的测定

(1) 抑菌活性的测定(滤纸片法)。用移液管吸取0.2mL的各菌悬液，轻轻吹于含有固体培养基的培养皿中，再用无菌涂布棒将菌悬液涂抹均匀。用无菌镊子夹取充分蘸有黄酮液的无菌滤纸片(直径6mm)，沥干后轻轻均匀贴在固体培养基表面，同样的方法设置空白组作对照(蘸有乙醇溶液的滤纸片)。

然后将各个培养皿放于恒温培养箱培养，观察抑菌效果，测量各抑菌圈的直径大小，每组重复测三次求其平均值(单位为mm)。

(2) MIC值的测定。将纯化后的马齿苋黄酮用倍比稀释法稀释成不同浓度，分别用1mL无菌移液管移取0.5mL，浸泡灭菌的滤纸片，摇匀，静置一段时间后，取出置于涂抹各菌悬液的固体培养基上，分散均匀。然后将各皿放在恒温培养箱，一段时间后取出观察并测量抑菌圈直径。无抑菌圈的浓度定则为最低抑菌浓度(MIC)[9]。

2试验结果与讨论

2.1马齿苋类黄酮的提取工艺结果

2.1.1响应面法优化马齿苋总黄酮的提取条件

采用Box-Behnken进行试验设计，设计及结果如表2。以乙醇浓度/%(A)、超声时间/min(B)、温度℃(C)为自变量，总黄酮得率Y为响应值，采用desinger expert软件对响应面分析。响应值Y与自变量A、B、C拟合得到响应面的二次方程为：Y(mg/g)=-281.35442+5.41226A+4.61381B+0.41839C-1.8500010-3AB+0.012425AC-6.3065010-3BC-0.03735A2-0.057617B2-0.015266C2。

2.1.2响应面试验设计及结果

响应面分析方案及方差分析如表2、表3所示。

表2　响应面分析方案及结果

表3　回归模型方差分析及结果

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01

由表3可知，模型中一次项A为显著，B极为显著，二次项B2显著，C2极为显著；整体模型的显著水平P<0.05，表明该模型极显著。Pred(R2)为0.9376而Adj(R2)是0.8252，说明拟合的模型方程较好，该模型可以用来指导实际实验。

2.1.3各因素相互作用对总黄酮得率的影响

乙醇浓度/%(A)、超声时间/min(B)、温度℃(C)三因素对提取率(Y)的响应面图，见图1。

从响应面3D图的最高点和等值线可以看出，有极值存在于所选范围内，是响应面的最高点，也是等值线最小椭圆的中心点；从响应面图的陡势可直观看出，乙醇浓度与温度相互作用的曲面变化显著，即对总黄酮得率影响最大。

2.1.4条件优化与验证

通过design expert软件得到的最优提取工艺条件为：乙醇浓度77.82%、超声时间36.72min、温度37.79℃，理论得率为21.8816mg/g。不足之处在于所测的马齿苋黄酮提取率较高，分析原因是本试验采用乙醇为提取剂，乙醇的极性大，把叶绿素等成分提取了出来，这就造成所测吸光值较大，因此计算出的马齿苋总黄酮得率偏大。

2.1.5最佳提取工艺确定

通过design expert软件得到实际最佳提取工艺条件：乙醇浓度75%、超声时间35min、温度35℃，试验所得结果为21.3517mg/g，实际得率与理论得率相误差为2.48%，二者较为接近。

2.2马齿苋类黄酮的抑菌效果

2.2.1马齿苋类黄酮的抑菌活性

由表4结合图2、3、4可知，马齿苋黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌等均有一定的抑制作用，浓度越高，其抑菌效果越明显，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显。马齿苋黄酮对大肠杆菌和酵母菌有较强的抑制作用，最低抑菌浓度均为0.313mg/mL；对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度为 0.156mg/mL。完全没有抑菌圈的最低样品浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

2.2.2最低抑菌浓度的测定结果

表4　马齿苋黄酮类化合最小抑菌浓度(MIC)

3结论

(1) 本文采用超声波辅助醇提取马齿苋类黄酮，与秦学会等的超声波水提马齿苋类黄酮得率8.24 mg/g相比较，黄酮得率有所提高[10]。该方法具有高效、快捷、低耗能，对提取物活性成分影响小等特点。

(2) 文中所选的响应面优化手段较于其他方法：具有可研究多因素间的交互作用，试验次数少、周期短，所求得回归方程精度高，分析结果更加清晰直观等优点，为天然活性物质的提取提供一定的参考与指导作用，实用性较高。

(3) 在3个单因素试验基础上，以总黄酮得率为响应值，运用响应面分析法得到最优提取工艺条件为：乙醇浓度75%，超声时间35min，温度35℃。

(4) 马齿苋黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌等均有一定的抑制作用，对大肠杆菌和酵母菌有较强的抑制作用，最低抑菌浓度均为0.313mg/mL；对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度为 0.156mg/mL。

参考文献：

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Study on Extraction Process of Flavonoids from Purslane and Their Antibacterial Effect

CHEN Guo-ni，SUN Fei-long，YAN Ya-ru

(School of Environmental & Chemical Engineering，Xi’an Polytechnic University，Xi’an 710048,China)

Abstract:In order to optimize the ultrasonic assisted extraction process of flavonoids from purslane，the response surface methodology with three factors and three levels was used according to the principles of central composite design (Box-Benhnken).The optimum extraction process parameters were obtained by the software of design expert; The bacteriostatic effect of flavonoids from purslane against E.coli，Staphylococcus aureus and saccharomycetes were measured using filter-paper method，as follows: the ethanol volume fraction was 75%，the extracting time was 35min，and the tempreture was 35℃.Under these conditions，the value of flavone extraction yield was21.3517 mg/g approximating to the predicted value 21.8816 mg/g.The results indicated that the response surface methodology could be used to optimize the ultrasonic assisted extraction process of flavonoids from purslane; E.coli，Saccharomycetes were inhibited by the flavonoids from purslane，the MIC was 0.313mg/mL，and Staphylococcus aureus was strongly inhibited，the MIC was 0.156mg/mL.

Key words:purslane; flavonoids; response surface methodology; extraction process; antibacterial effect

doi:10.3969/j.issn.1005-1295.2016.01.002

中图分类号：TS201.2

文献标志码:A

文章编号：1005-1295(2016)01-0006-05

作者简介：陈国妮( 1989-)，女，硕士，研究方向为天然活性物质的提取。通信作者： 孙飞龙(1975-)，男，博士，副教授，研究方向为天然活性物质的提取，

通信地址：710048 陕西西安市碑林区金花南路19号 西安工程大学环境与化学工程学院，E-mail: sunfeilong@xpu.edu.cn。

基金项目：陕西省教育厅科研计划项目资助(15JK1315)；西安工程大学博士科研启动项目(BS1011)

收稿日期：2015-07-30;修稿日期： 2015-08-24