NF-κB寡核苷酸诱骗剂诱导的大鼠耐受型树突状细胞及其免疫学特性观察

蹇孝丽，尹向飞，岳萍，胡恒贵，蒋红梅（贵州医科大学，贵阳550004；厦门市第二人民医院；蚌埠医学院第三附属医院）



NF-κB寡核苷酸诱骗剂诱导的大鼠耐受型树突状细胞及其免疫学特性观察

蹇孝丽1，尹向飞2，岳萍1，胡恒贵3，蒋红梅1
（1贵州医科大学，贵阳550004；2厦门市第二人民医院；3蚌埠医学院第三附属医院）

摘要：目的 用核因子κB（NF-κB）寡核苷酸诱骗剂（ODN Decoy）诱导大鼠耐受型树突状细胞（DC）并负载牛Ⅱ型胶原（BⅡC），评价其免疫学特性。方法 用GM-CSF和IL-4诱导SD大鼠脾脏单个核细胞分化成DC，将其分为对照组及实验1、2组，均继续加入GM-CSF、IL-4，同时实验1、2组加入ODN Decoy，培养7 d实验2组加入BⅡC。流式细胞术检测细胞表面共刺激分子CD80、CD86，同种异体淋巴细胞刺激试验评价淋巴细胞增殖情况及其对BⅡC和人血清刺激的反应，检测上清液中Th1／Th2细胞因子IFN-γ／IL-10。结果 与对照组相比，实验1、2组CD80、CD86表达均降低（P均＜0．05）；实验1组淋巴细胞增殖程度及IFN-γ明显降低（P均＜0．05），IL-10无明显变化；实验2组加入BⅡC后淋巴细胞增殖程度及IFN-γ、IL-10均无明显变化（P均＞0．05）。实验2组中，与加入BⅡC相比，加入健康人血清后淋巴细胞明显增殖（P＜0．05），IFN-γ升高，IL-10降低（P均＜0．05）。结论 用NF-κB ODN Decoy成功诱导获得耐受型DC。该DC刺激同种异体淋巴细胞反应的能力较低，且抑制淋巴细胞免疫反应向Th1方向偏移；负载BⅡC后刺激的淋巴细胞对该抗原特异性耐受，而对无关抗原的免疫应答无明显影响。

关键词：树突状细胞；核因子κB；寡核苷酸；诱骗剂；Ⅱ型胶原；免疫耐受；大鼠

树突状细胞（DC）是重要的抗原递呈细胞，在免疫反应的激活和调节中起关键作用，影响免疫耐受和免疫反应之间的平衡。未成熟DC由于低表达协同刺激分子（CD80、CD86、CD40等），激活初始T细胞的能力很弱，导致T细胞的“无能”或低反应，从而诱导抗原特异性耐受［1，2］。利用未成熟DC诱导免疫耐受，可以阻止自身免疫反应，用于器官移植排斥反应、变态反应、自身免疫性疾病及慢性炎症的治疗［3］。类风湿性关节炎（RA）是常见的自身免疫性疾病。Ⅱ型胶原（ⅡC）是关节软骨的主要成分，是与RA密切相关的自身抗原。核因子κB（NF-κB）在DC成熟信号传导通路中起决定性作用［4，5］，其寡核苷酸诱骗剂（ODN Decoy）可阻断转录因子调节靶基因的表达，抑制DC表型和DC成熟，从而获得耐受型DC［6］。2012～2014年，我们采用与NF-κB特异性结合位点（靶基因启动区）一致的ODN Decoy处理大鼠DC获得耐受型DC，并使其负载牛Ⅱ型胶原（BⅡC），评价其免疫学特性，为获得治疗RA的抗原特异性耐受型DC疫苗提供实验依据。

1　材料与方法

1．1材料 清洁级雌性SD大鼠和雄性Wistar大鼠，7～8月龄，体质量250～320 g。大鼠NF-κB ODN Decoy由上海生工生物工程公司合成［7］。

1．2DC的分离与培养 取雌性SD大鼠脾脏制成细胞悬液，密度梯度离心法分离单个核细胞，接种于6孔板。待单核细胞贴壁后去除培养液，用含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞至2．5 mL，加入GM-CSF 30 ng／mL、IL-4 20 ng／mL（Peprotech公司）诱导DC扩增。培养第3天每孔再加完全RPMI 1640培养液1 mL，并补充GM-CSF至30 ng／mL、IL-4至20 ng／mL；第6天离心弃1．5 mL上清液，再补足相应新鲜培养液和GM-CSF、IL-4；第8天收获细胞行台盼蓝染色，计数细胞总数和活力＞92%。用PE-OX-62抗体行单细胞染色检测DC特异性标志OX-62，其表达率＞70%，说明获得了纯度较高的DC。

1．3细胞分组与耐受型DC的构建 将DC细胞分为3组，均加入终浓度30 ng／mL的GM-CSF、20 ng／mL的IL-4，同时实验1、2组加入终浓度为5 μmol／L 的ODN Decoy，培养7 d实验2组再加入终浓度50 mg／L的BⅡC（Sigma公司）。第8天收集各组细胞进行实验。

1．4免疫表型CD80和CD86检测 将各组细胞用PBS重悬为单细胞悬液，加入PE-CD80抗体和FITC-CD86抗体行单细胞双标染色，上流式细胞仪检测荧光强度，以荧光强度表示CD80和CD86的表达强度。

1．5免疫活性观察 采用体外同种异体淋巴细胞刺激试验。将上述3组细胞加入丝裂霉素C，用RPMI 1640完全培养基重悬，调整密度为2×105／mL，作为刺激细胞；取雄性Wistar大鼠脾脏，研磨，制成细胞悬液，密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI 1640培养液重悬，调整密度为1×106／mL，作为反应细胞。取对照组细胞100 μL，加入反应细胞100 μL；实验1组细胞100 μL，加入反应细胞100 μL；取实验2组细胞100 μL分成两管各50 μL，均加入对照组细胞50 μL和反应细胞100 μL，然后分别加入BⅡC（终浓度2 μg／mL）和健康人血清20 μL（56℃、30 min灭活）。每组设8个复孔，置5% CO2培养箱、37℃培养68 h，取上清液检测细胞因子IFN-γ和IL-10。加入MTT继续培养4 h后，弃上清，加入二甲亚砜振荡混匀，于酶标仪570 nm处测定淋巴细胞增殖的OD值。

2　结果

2．1各组D80、CD86表达强度比较 见表1。

表1　各组CD80、CD86表达强度比较（珔x±s）

2．2各组细胞增殖情况比较 对照组OD值为0．346±0．056，实验1组为0．279±0．034，实验2组加入BⅡC和人血清后的OD值分别为0．438± 0．092、0．712±0．073。与对照组相比，实验1组刺激淋巴细胞增殖程度显著降低（P＜0．05）。与实验2组加BⅡC比较，实验2组加人血清后淋巴细胞增殖程度显著升高（P＜0．01）。

2．3各组细胞上清液中IFN-γ、IL-10水平比较见表2。

表2　各组细胞上清液中IFN-γ、IL-10水平比较（ng／L，珔x±s）

3　讨论

DC能够刺激初始型T细胞增殖，是机体免疫系统反应的启动者，在调节免疫激活和免疫耐受的平衡过程中起重要作用［8］。DC的这种能力与其成熟状态有关，只有未成熟的DC才具有耐受原性［9，10］。NF-κB作为一种转录调节因子，其活化对DC激活T细胞起关键作用［11］。本研究采用ODN Decoy处理大鼠脾脏来源的DC，结果显示，处理后的DC其CD80表达强度明显低于对照组，而CD86几乎不表达，是一种相对不成熟的DC表型特征。

T细胞活化后可产生大量细胞因子，参与疾病的发生发展。IFN-γ是主要由Th1细胞产生的促炎性细胞因子，而IL-10是由Th2产生的强力的抑制性因子，可下调促炎性因子表达，发挥免疫耐受作用。T细胞活化需要抗原递呈细胞提供信号，未成熟DC由于缺乏激活T细胞的第二信号，导致T细胞无能或低反应，从而诱导免疫耐受［12］。本研究显示，耐受型DC刺激混合淋巴细胞反应的能力显著低于对照组，并且其明显抑制活化T细胞产生IFN-γ，但不影响IL-10分泌，表明耐受型DC能抑制T细胞向Th1方向偏离。与以往文献［13］报道相似。本研究在DC培养体系中加入NF-κB ODN Decoy后，又加入BⅡC，使其对BⅡC完成摄取和表达过程，制备负载BⅡC的耐受型DC。结果显示，负载BⅡC后细胞表面CD80和CD86的表达仍然保持与耐受型DC相似的低表达状态。同时，在体外将BⅡC和人血清蛋白分别加入负载BⅡC的耐受型DC、成熟DC和同种异体淋巴细胞的混合培养体系中，结果显示，淋巴细胞受到人血清蛋白的刺激而显著增殖，且高分泌IFN-γ，低分泌IL-10，免疫平衡向Th1方向偏移，呈现免疫活化状态；而对BⅡC的刺激则表现为增殖抑制，且低分泌IFN-γ，高分泌IL-10，免疫平衡向Th2方向偏移，呈现免疫耐受状态。负载BⅡC的耐受型DC由于相对低地表达CD80和CD86等共刺激分子，不能充分提供BⅡC特异性淋巴细胞活化的共刺激信号，而仅能提供BⅡC特异性抗原刺激的第一信号，致使淋巴细胞表现为针对BⅡC的特异性无能或低反应性；而对人血清蛋白，负载BⅡC的耐受型DC不能传达特异性抑制信号，而通过成熟DC刺激T细胞活化，表现出明显的增殖反应。这种负载了特异性抗原的耐受型DC可能诱导淋巴细胞针对该抗原的特异性耐受，却并不干扰淋巴细胞针对其他抗原的应答反应。

综上所述，用NF-κB ODN Decoy诱导的耐受型DC表现了较低的体外刺激混合淋巴细胞的能力，将其负载抗原后表现为相对特异性的致免疫耐受作用。提示应用Decoy技术可望获得耐受型DC疫苗，为RA的治疗提供新的思路。

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Immunological characters of rat tolerogenic dendritic cells induced by NF-κB oligodeoxynucleotide decoy

JIAN Xiaoli1，YIN Xiangfei，Yue Ping，HU Henggui，JIANG Hongmei
（1 Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

Abstract：Objective To evaluate the immunological characters of rat tolerogenic dendritic cells（DCs）induced by nuclear factor κB oligonucleotides decoy（NF-κB ODN decoy）and loaded with bovine collageb typeⅡ（BⅡC）in vitro．Methods The rat spleen monocytes were induced by recombinant GM-CSF and IL-4 in vitro to differentiate into DCs．Those DCs were divided into three groups：the control group which was added with cytokines，experimental group 1 which was dealt with NF-κB ODN decoy，and the experimental group 2 which was dealt with NF-κB ODN decoy and followed by BⅡC after being cultured for 7 days．The expression of CD80 and CD86 was analyzed by using flow cytometry．Allogeneic lymphocyte stimulation test was used to evaluate the lymphocyte proliferation and the reaction for BⅡC and human serum stimulation．Meanwhile，the concentration of IL-10 and IFN-γ in supernatant was detected．Results Compared with the control group，the CD80 and CD86 expression intensities in the experimental groups 1 and 2 were decreased（all P＜0．05）；the lymphocyte proliferation and expression of IFN-γ was significantly decreased in the experimental group 1（all P＜0．05），but the IL-10 showed no significant difference．In the experimental group 2，after adding BⅡC，lymphocyte proliferation and expression of IFN-γ and IL-10 showed no significant difference （all P＞0．05）．However，after adding healthy human serum，the lymphocyte proliferation and expression of IFN-γ was significantly increased，and the expression of IL-10 was decreased in the experimental group 2（all P＜0．05）．Conclusions NF-κB ODN decoy successfully induced to construct rats′tolerogenic DCs．The tolerogenic DC exhibited low capability to stimulate lymphocytes and inhibited the lymphocyte immune response to Th1 shift direction．When loaded with BⅡC，the lymphocytes that stimulated by BⅡC exhibited specific tolerance against the specific antigens but had no significant effect on the antigen-independent immune response．

Key words：dendritic cells；nuclear factor-κB；oligonucleotides；decoy；Ⅱcollagen；immune tolerance；rats

收稿日期：（2015-09-29）

通信作者简介：蒋红梅（1973-），女，硕士研究生导师，教授，主要研究方向为自身免疫性疾病。E-mail：646117948＠qq．com

作者简介：第一蹇孝丽（1990-），女，硕士研究生，主要研究方向为自身免疫性疾病。E-mail：993249570＠qq．com

基金项目：贵州省科技厅贵阳医学院联合基金计划项目（黔科合LG字［2012］004号）。

中图分类号：R329．2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X（2016）02-0017-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．006