SETD2 mRNA在鼻咽癌组织中的表达及其与LMP1的关系

赵利刚，林中原，覃灵燕，李音音，莫武宁，杨峥（广西医科大学第一附属医院，南宁530021）



SETD2 mRNA在鼻咽癌组织中的表达及其与LMP1的关系

赵利刚，林中原，覃灵燕，李音音，莫武宁，杨峥
（广西医科大学第一附属医院，南宁530021）

摘要：目的 检测鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞株中人源含SET结构域蛋白2（SETD2）mRNA的表达，并分析其与EB病毒编码的潜伏膜蛋白1（LMP1）的关系。方法 取42例初诊鼻咽癌患者（观察组）和15例慢性鼻咽黏膜炎症患者（对照组）的手术活检组织标本，另取人高分化鼻咽癌细胞株CNE1和稳定转染LMP1基因的CNE1细胞株CNE1-LMP1，采用实时荧光相对定量PCR方法检测观察组、对照组鼻咽组织以及CNE1-LMP1与CNE1中的SETD2 mRNA。结果 观察组SETD2 mRNA相对表达量为1．596±0．916，低于对照组的2．194±1．144，且随淋巴结转移分级升高而降低（P均＜0．05）；CNE1-LMP1中SETD2 mRNA相对表达量为0．676±0．042，低于CNE1的0．870±0．114（P＜0．05）。结论 SETD2在鼻咽癌组织中的表达下调，可能与鼻咽癌的发生发展有关，SETD2基因表达下调可能与EB病毒编码的LMP1有关。

关键词：鼻咽癌；人源含SET结构域蛋白2；潜伏膜蛋白1

鼻咽癌是一种极具地域性的肿瘤，我国鼻咽癌发病率和病死率均居世界首位，严重影响人们的生存质量［1］。鼻咽癌的发生、发展是多因素综合作用的结果，与遗传易感性、EB病毒感染及环境因素紧密相关。研究发现，人源含SET结构域蛋白2 （SETD2）是一个肿瘤抑制因子［2］，参与转录延伸和DNA同源重组修复［3，4］。该基因在乳腺癌［5］、肾癌［6］、白血病［2］中表达异常，但在鼻咽癌中的研究较少。EB病毒编码的潜伏膜蛋白1（LMP1）对促进癌症发生、发展和诱导相关抑癌基因失活具有重要作用［7］。2014年11～12月，我们检测了鼻咽癌组织中以及人鼻咽癌细胞株CNE1和转染LMP1的细胞株CNE1-LMP1中SETD2 mRNA的表达，分析其与LMP1基因的关系。

1　材料与方法

1．1材料 收集我院2011年2月～2014年10月收治的初诊鼻咽癌患者42例（观察组），男31例、女11例，年龄23～74岁、中位年龄47．5岁；慢性鼻咽黏膜炎症患者15例（对照组），男12例、女3例，年龄20～59岁、中位年龄41岁。均经病理学检查证实。取两组活检组织标本，－80℃保存。人高分化鼻咽癌细胞株CNE1来自广西医科大学耳鼻喉实验室，稳定转染LMP1基因的CNE1细胞株CNE1-LMP1购自湖南中南大学湘雅实验中心，细胞均在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1．2SETD2 mRNA检测 采用实时荧光相对定量PCR方法。使用TRIzol试剂提取鼻咽组织及细胞株CNE1-LMP1、CNE1的总RNA。逆转录合成cDNA，－20℃保存。内参基因GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，产物长度138 bp。目的基因SETD2由上海英潍捷基公司合成，上游引物序列5′-TCCAACAGTCTATGGTGTGA-3′，下游引物序列5′-TGAGCTGTGAAAATCTGTTG-3′，产物长度114 bp。ABI7300定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增反应，反应体系：20 μL（SYBR GreenⅠ核酸染料10 μL，ROX 0．4 μL，上、下游引物各0．8 μL，模板cDNA 2 μL，以及去离子水6 μL）。PCR循环条件：95℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，共40个循环。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证目的条带大小，确定PCR产物的特异性。采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，ΔΔCt＝实验组（Ct目的基因－CtGAPDH）－对照组（Ct目的基因－CtGAPDH）。重复检测3次取平均值。

1．3统计学方法 采用SPSS16．0统计软件。计量资料以±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2　结果

2．1各组SETD2 mRNA表达比较 观察组和对照组的SETD2 mRNA相对表达量分别为1．596± 0．916、2．194±1．144，两组比较P＜0．05。CNE1-LMP1与CNE1的SETD2 mRNA相对表达量分别为0．676±0．042、0．870±0．114，两者比较P＜0．05。

2．2SETD2 mRNA表达与鼻咽癌患者临床病理特征的关系 见表1。

3　讨论

鼻咽癌发生部位较隐蔽，且早期症状不典型，患者确诊时多已至中晚期，失去最佳治疗时机，严重影响患者的生存质量。寻找鼻咽癌早期诊断的生物学标记物对鼻咽癌的治疗具有重要意义。癌症发生的分子机制包括癌基因的激活和抑瘤基因的失活［8］。抑癌基因SETD2位于染色体3p21．3位点，蛋白大小为230 kD，属于含有SET结构域的组蛋白甲基转移酶家族蛋白，可特异性催化组蛋白H3K36位点三甲基化修饰，SETD2功能破坏可导致H3K36me3功能丢失［9］。SETD2-H3K36me3通路的功能破坏是白血病发生、发展的表观遗传机制［2］。组蛋白甲基化在真核转录调控起重要作用，SETD2基因蛋白包含转录激活域，与高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ有关，影响基因表达的调控。另外，SETD2还参与基因的同源重组修复［10］。SETD2主要定位于细胞核内，胞质中也有少量分布［11］。SETD2基因在乳腺癌、肾癌、白血病等恶性肿瘤中存在表达降低或缺失，且在肾透明细胞癌中，该基因突变与癌症进展和不良预后有关［12］，说明SETD2与肿瘤的发生、发展关系密切。研究表明，SETD2对p53参与的细胞凋亡过程具有明显的促进作用，可增强大多数p53下游靶基因的转录活性，是p53正向调控因子［13］。本研究发现，鼻咽癌组织中SETD2 mRNA表达较鼻咽部炎症组织明显降低，且随淋巴结转移分级升高而降低。提示SETD2 mRNA表达降低在鼻咽癌发生、发展过程中可能是一个早期事件，随着癌症进一步发展，其表达进一步下降。由此推测，SETD2 mRNA表达降低与鼻咽癌的发生、发展密切相关，SETD2可能作为鼻咽癌潜在的分子生物学标记物。

表1　SETD2　mRNA表达与鼻咽癌患者临床病理特征的关系（珔x±s）

EB病毒是人类发现的第一种与肿瘤密切相关的病毒，与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和一部分胃癌等均有关，尤其在鼻咽癌中的检出率极高，是鼻咽癌三大病因之一［14］。鼻咽癌患者的死亡原因主要是肿瘤转移和复发，而EB病毒编码的致瘤蛋白LMP1可促使癌细胞侵袭转移，且能诱导相关抑癌基因失活，对促进癌症的发生发展起重要作用［7］。故研究抑癌基因SETD2与LMP1的关系并探讨其作用机制，对阐明鼻咽癌的发病机制具有重要意义。本研究发现，鼻咽癌转染细胞株CNE1-LMP1中的SETD2 mRNA表达低于CNE1，表明鼻咽癌细胞中SETD2表达降低与LMP1有关，LMP1可能通过某些信号转导通路对其进行靶向调控或者诱导DNA甲基转移酶的表达［15，16］，引起SETD2基因表达水平的改变，因LMP1可促使p53蛋白的泛素化和降解［17］，SETD2又可与p53免疫共沉淀［5］，故LMP1也可能以促进泛素化和蛋白酶降解的方式作用于SETD2基因，其具体机制尚待进一步研究。

EB病毒感染普遍被认为是鼻咽癌主要病因之一。在本研究中EB病毒致瘤蛋白LMP1可下调抑癌基因SETD2的表达，而SETD2与鼻咽癌的发生、发展有关。综上所述，SETD2可能成为鼻咽癌早期诊断的新的分子生物学标记物。

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·基础研究·

Expression of SETD2 mRNA in nasopharyngeal carcinoma and its relationship with LMP1

ZHAO Ligang，LIN Zhongyuan，QIN Lingyan，LI Yinyin，MO Wuning，YANG Zheng
（The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

Abstract：Objective To detect the SETD2 mRNA expression in the nasopharyngeal carcinoma（NPC）tissues and NPC cell line，and to explore its relationships with latent membrane protein 1（LMP1）coded by EB virus．Methods Real-time fluorescent relatively quantitative PCR was used to detected SETD2 mRNA expression in 42 nasopharyngeal carcinoma tissues（observation group），15 non-cancerous nasopharyngeal tissues（control group），and high-differentiated nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE1 and CNE1-LMP1．Results The SETD2 mRNA expression of the observation group （1．596±0．916）was lower than that of the control group（2．194±1．144）（P＜0．05），and decreased with the increased lymph node metastasis grading．The SETD2 mRNA expression of CNE1-LMP1（0．676±0．042）was lower than that of CNE1（0．870±0．114）（P＜0．05）．Conclusions The declined expression of SETD2 mRNA indicated that it might be involved in the development and progression of nasopharyngeal carcinoma．The down-regulation of SETD2 gene was related with EBV-LMP1 to some degree．

Key words：nasopharyngeal carcinoma；SETD2；latent membrane protein 1

收稿日期：（2015-09-30）

通信作者简介：杨峥（1985-），男，主管技师。主要研究方向为鼻咽癌、白血病的发病机制。E-mail：jackyyoung＠foxmail．com

作者简介：第一赵利刚（1988-），男，在读硕士生。主要研究方向为鼻咽癌的发病机制。E-mail：zhlg0771＠163．com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81460414）。

中图分类号：R739．6

文献标志码：A

文章编号：1002-266X（2016）02-0020-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．007