林木转抗虫基因育种研究综述

唐季云 （江苏省南通市通州区林业技术指导站 226300）李 敏 王 莹 张 健 （江苏沿江地区农业科学研究所，江苏省南通市 226541）

林木转抗虫基因育种研究综述

唐季云 （江苏省南通市通州区林业技术指导站 226300）李 敏 王 莹 张 健 （江苏沿江地区农业科学研究所，江苏省南通市 226541）

林木转抗虫基因分子育种技术是利用DNA重组技术，将天然或构建的外源抗性基因导入林木染色体，从而产生具有外源基因表达的转基因林木。为促进林木转抗虫基因工程技术的进一步发展，对国内外林木抗虫基因工程现状进行了综述，并对其研究发展中存在的问题进行了探讨，以供参考。

林木；转抗虫基因；分子育种技术

林木转抗虫基因分子育种技术是利用DNA重组技术，将天然或构建的外源抗性基因导入林木染色体中，从而产生具有外源基因表达的转基因林木[1]。自20世纪80年代以来，由于生物技术的迅猛发展，随着各种抗虫基因的发现和克隆以及抗虫基因在高等植物细胞中的表达等方面的深入研究，加速了林木转抗虫基因工程技术的发展，为林木抗虫育种开辟了一条全新的、突破性的途径。目前，已对杨树、火炬松、核桃、刺槐、枫香、桉树、欧洲黑杨等树种进行了抗虫分子育种方面的研究，其中，部分树种已获得转基因再生植株，并建成了相关品系，且已在生产上进行了应用[2]。为促进林木转抗虫基因工程技术的进一步发展，笔者对国内外林木抗虫基因工程现状进行了综述，并对其研究发展中存在的问题进行了探讨，以供参考。

1 抗虫基因的研究概况

林木转抗虫基因育种的关键是获得有用的抗虫基因，目前，人们已从细菌、植物本身及昆虫体内发现并分离出了许多抗虫基因，且有的已导入植物并获得了抗虫转基因植株。目前，抗虫基因的主要来源有三类:第一类是从微生物中分离出来，其抗虫基因主要是苏云金杆菌毒蛋白基因；第二类是从植物组织中分离出来，其抗虫基因主要为蛋白酶抑制剂基因、植物凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因等；第三类是从动物体内分离的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。

1.1 微生物中来源的抗虫基因

主要为苏云金杆菌毒蛋白基因。苏云金杆菌（Bacillus thuringicnsis，Bt），为革兰氏阳性菌，属芽孢杆菌科芽孢杆菌属，是一种具有特异性杀虫活性的蛋白质[3]。1989年，Hofte和whitely将当时已报道的42个Bt毒蛋白基因，根据毒蛋白基因的核苷酸序列同源性和抗虫谱的差异性分为4大类和14个亚类，其中CryⅠ对鳞翅目、CryⅡ对鳞翅目和双翅目、CryⅢ对鞘翅目、CryⅣ对双翅目有特异毒性[4]。随着新分离的和人工合成的Bt毒蛋白基因数量的持续增多，根据其同源性将它们分为64大类、116个亚类，抗虫范围也得到了不断地扩大。

1987年，比利时Mentagn实验室的Veack等[5]首次报道获得了抗虫基因植株，该植株是用CryⅠA[b]基因与NPTⅡ基因融合，转入烟草后得到转基因烟草植株，在实验室条件下，用烟草天蛾幼虫检测抗虫性，结果证明其有一定的抗虫效果。1990年，伍宁丰等[6]成功将对鳞翅目昆虫有毒性的Bt毒蛋白基因导入欧洲黑杨并获得转基因植株。同年，中科院上海植生所和南京林业大学合作，将Bt基因导入毛白杨和杂种杨[7]。1991年，McCown等[8]利用电击法将抗虫基因（Bt）导入杂种杨（Populus alba L×P.grandidentata 和 Populus nigra L.×P.trichocarpa），并获得了抗舞毒蛾和天幕毛虫的转基因植株。1993年，田颖川等用带有35S-Ω-Bt-NOS双元载体的农杆菌LBA4404转化欧洲黑杨获得转基因植株，经抗虫测定证实，杨尺蠖和舞毒蛾的死亡率达80%～100%，并对害虫的生长和发育有明显的抑制作用。1994年，KLeiner等获得抗枯叶蛾毛虫和吉普赛蛾的转基因杂种杨NC5339。同年，Shin等将Bt基因转入欧洲落叶松并检测到该基因的表达。Pilaee于1995年将切割蛋白酶基因转入杨树，转化植株的食叶昆虫死亡率达40%。同年，美国威斯康星、麦迪顿大学等成功地将抗虫Bt基因与蛋白酶抑制剂基因导入白云杉，有效防止了卷叶蛾的危害。1995年，郑均宝等[9]用含有完全改造的Bt基因表达载体PB 48.7和部分改造Bt基因表达载体PB 48.7转化白杨741雄株，获得了转基因植株。中国林科院和北京大学于1996年合作开展了抗蛀干害虫天牛的转基因研究[10]。1996年，Wang等也成功获得转Bt基因的欧洲黑杨植株，经2～3年的抗虫测定和优良性状选择，已有3个无性系(12、153、192)在中国6个省进行种植评估。Dandekar等(1998)在核桃上也获得了转crylA基因的抗虫植株。1999年，郝贵霞等成功将广谱抗虫基因豌豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）基因导入毛白杨，并获得转基因植株。2000年，伍宁丰等[11]将特异毒杀鳞翅耳昆虫的神经毒素AalT基因用农杆菌介导法导入南方杨树N-106中，获得62株再生植株，经Southern杂交检测，目的基因成功整合到了基因组中，杀虫试验证实转基因杨树对一龄期舞毒蛾生长有明显的抑制作用。2004年，姜静等[12]用农杆菌介导的叶盘法，将Bt基因C肽序列和蜘蛛杀虫肽组成的融合基因导入小黑杨，抗虫试验表明，转基因株系具有明显的抗虫效果。综上截至目前，已知的表达Bt基因的树种有杨树、桦树、苹果、核桃、落叶松、花旗松、火炬松和云杉等。

1.2 植物来源的抗虫基因

1.2.1 蛋白酶抑制剂基因

天然的蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor，PI)广泛存在于动植物及微生物体内，可使害虫消化不良，延长其发育时间，减少每年的繁殖代数，降低害虫的种群数量[13]。其作用机理是与昆虫肠内蛋白酶或病原微生物蛋白酶形成酶抑制剂复合物(EI)，阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用，同时刺激昆虫消化酶的过量分泌，通过神经系统反馈，使其产生厌食反应，最终导致昆虫消化不良而影响正常发育，甚至死亡[14]。目前，在植物中发现有3类PI，分别是丝氨酸PI、巯基PI和金属PI，并已分离出多种蛋白酶抑制剂基因或cDNA克隆。其中最引人瞩目的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、马铃薯蛋白酶抑制剂基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因。1987年，Hilder[15]首次将CPTI基因成功转入烟草获得了抗虫转基因植株，转基因的烟草对烟芽夜蛾、米穗蛾、棉铃虫和粘虫等具有毒杀和抑制生长的作用。Mcnabb等[16]首次将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因（pin ll）导入杨树NC5399无性系。Klopfenstein等[17]将pin ll基因用农杆菌介导法导入杂交杨（银白杨×大齿杨），ELISA和Western Blot检测表明，转基因植株表达了PIN ll蛋白，并能明显抑制幼虫的生长。近年来，国内外学者还相继把CPTI基因转入一些重要的经济植物中，如水稻、油菜、白薯、杨树和苹果等。

1.2.2 植物凝集素基因

植物凝集素（lectin）是一类具有特异糖结合活性的蛋白，它们能聚集细胞和沉淀糖蛋白[18]。其抗虫机理是当其被昆虫取食后，外源凝集素在昆虫的消化道中与肠道围食膜上的糖蛋白相结合或与消化道上皮细胞的糖缀合物相结合，从而影响营养的吸收。同时，外源凝集素还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，促进消化道内细菌繁殖，对害虫本身造成危害，抑制害虫生长发育繁殖，从而达到杀虫的目的[19]。

目前成功用于植物抗病虫害基因工程的植物凝集素基因主要有雪花莲凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、麦胚凝集素基因、苋菜凝集素基因及核糖体失活蛋白基因等[20]。英国剑桥农业遗传公司和Durham大学把分离出的雪花莲凝集素基因成功地导入烟草，结果转基因烟草对蚜虫表现出了明显抗性。Boulter等[21]在获得能稳定表达外源豌豆凝集素基因的转基因烟草植株之后，进一步和转基因cpti植株杂交，筛选出既能表达豌豆凝集素又能表达CPTⅠ的双价转基因烟草，其抗虫能力显著提高，这也表明基因间的协同作用有可能大大提高作物抗性。目前报道的转植物凝集素基因的植物有水稻、烟草、马铃薯、小麦、番茄等，均表现出对桃蚜、水稻褐飞虱、菜园夜蛾和麦长管蚜等害虫的抑制和抗性[22]。

1.2.3 淀粉酶抑制剂基因

淀粉酶抑制剂(α-Amylase Inhibitor，α-AI)是一种热稳定的糖蛋白质，它能抑制哺乳动物及昆虫体内的α-淀粉酶的活性，从而阻断对摄取食物中淀粉成分的消化[23]。淀粉酶抑制剂在植物界中普遍存在，尤其是在禾谷类作物和豆科作物的种子中，含量更为丰富。其抗虫机理与蛋白酶抑制剂相似，对昆虫消化道内α-淀粉酶的活性有抑制作用，通过使摄入的淀粉无法正常消化水解，阻断其主要能量来源。同时，α-AI和淀粉消化酶结合形成的复合物也会刺激昆虫的消化腺过量分泌消化酶，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应，最后导致非正常发育或死亡[24]。

α-AI是一种天然的抗虫蛋白，对某些害虫的α-淀粉酶具有抑制作用，将它用于转基因抗虫，安全性好，易于为公众接受。用转小麦α-AI基因的烟草叶片喂养鳞翅目幼虫，其死亡率增加30%～40%。目前，已从小麦和大麦中克隆出该基因转化到烟草中，且能在烟草植株中准确、稳定地表达，并在烟草种子发育过程中积累[25]。

1.3 动物来源的抗虫基因

此类是从动物体内分离的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。如蝎子、蜘蛛、胡蜂、蚂蚁等产生的毒素，能使害虫神经麻痹，使其失去知觉不能正常取食而死亡；同时，蝎子和蜘蛛产生的毒素一般只能专一性作用于昆虫，而对哺乳动物无害或毒性很小[26]。其抗虫原理是将昆虫激素基因转入植物后可扰乱害虫体内激素平衡，干扰昆虫交配、栖息习惯或影响发育，从而达到控制虫害的目的[27]。

胡延章等[28]利用东亚钳蝎软瘫型昆虫毒素基因（BmKlT4）获得了抗烟草天蛾、棉铃虫和大豆食心虫的烟草植株，且抗虫植株自交后代仍表现出较强的抗虫性。伍宁丰等将昆虫特异性神经蝎毒素（aait）基因转入南方杨树N-106中，获得了再生植株，喂虫实验表明，转基因植株能明显抑制一龄舞毒蛾幼虫的生长。

2 林木转抗虫基因育种中存在的问题与前景展望

2.1 林木抗虫分子生物学基础研究薄弱

林木抗虫分子生物学基础研究还很薄弱，总体上不如农作物抗虫害研究深入。但近几年，国外做了相关研究并取得了一定成绩，在此基础上，我国克隆出了抗虫性基因或改造的抗虫性基因，这对我国林木抗虫分子生物学基础研究起到了良好的推动作用。

2.2 转基因的转化效率低且表达水平不高

由于转基因的效率受许多因素的影响，当外源基因转入时，可能会引起宿主染色体的插入突变；同时，大多数林木还未建立有效的组培再生和转基因系统，能获得转基因植株的树种极少，目前多数研究是围绕杨树开展的；此外，在有些转基因林木中，还存在转基因不表达或在不同林木中表达强度不一等问题。

2.3 昆虫对Bt杀虫晶体蛋白会产生抗性

与化学杀虫剂相比，虽然昆虫对Bt杀虫剂产生的抗性发展缓慢，但已有相关资料证明，在Bt抗虫转基因植株在选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性，这是林木抗虫基因工程研究中存在的较为严重问题。要解决该问题，需要采取组合2个或2个以上的非竞争性Bt杀虫晶体蛋白基因，同时或分别导入转基因植物体内，或将不同杀虫机理的基因组合转入植物体内。

2.4 转基因的抗性表达往往不理想

林木的抗虫遗传机理多数属于多基因控制，这给树木基因工程带来了难度，其转基因的抗性表达往往不理想。因此，如何在多基因中寻找到关键基因显得尤为重要，此外，还可从寄主以外的材料中找到抗性基因。

2.5 抗虫机理不清楚

目前，林木转抗虫基因虽对抗虫性检测进行了大量分子及大田试验研究，但其抗虫机理还不十分清楚。因此，今后应加强这方面的深入研究，以利于培育抗性持久的林木，为林木生产减少损失，提高生态效益。此外，还应不断利用更新、更强和更专一的启动子，调节基因表达，并努力解决环境因素和植物体自身活动对外源基因表达的影响，克服传统标记基因的局限性。可以预计，将来最有前景的工作就是外源基因精确定位到植物体，使林木在不同的生长时期、不同的部位对相应害虫表达足够的抗性。

3 结 论

林木生长周期长，用常规育种方法不仅时间长、见效慢，而且可操作性差，而基因工程为林木抗虫育种开辟了一条新途径，应用基因工程进行林木抗虫育种有其显著的优越性，不仅可大大缩短育种周期，还可在基因水平上改造林木抗性遗传物质，更具科学性和精确性，提高了育种的目的性和可操作性，扩大了育种范围，打破物种之间的生殖障碍，实现基因的共通性。因此，今后应加大对林木转抗虫基因的研究投入，并有效地与常规的林业技术措施相配合，从而培育出更多有价值的抗虫基因工程林木。

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2016-05-13

江苏省农业科技自主创新项目[编号：CX(14) 5094]；江苏省“333工程”科研项目(编号：BRA2015125)，江苏省“六大人才高峰”项目(编号：NY-042)。