芒针促进急性脊髓损伤恢复的机制研究*

全仁夫，李长明，，谢尚举，杨宗保

(1.浙江省萧山中医院，浙江 杭州 310009;2.厦门大学医学院，福建 厦门 361102)

芒针促进急性脊髓损伤恢复的机制研究*

全仁夫1，李长明1，2，谢尚举1，杨宗保2

(1.浙江省萧山中医院，浙江 杭州 310009;2.厦门大学医学院，福建 厦门 361102)

目的:应用改良Allen’s造模法制备大鼠急性脊髓损伤(SCI)模型，观察芒针(elongated needle)对大鼠急性脊髓损伤后促炎性因子表达及神经细胞凋亡的影响，并探讨与NF-κB信号通路的可能作用机制。方法:成年雄性SD大鼠36只，按随机数字表法分为假手术组、模型组、芒针组，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测炎性因子肿瘤环死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的含量和核转录因子(NF-κB)含量的变化，用原位末端标记法(TUNEL)检测脊髓损伤后神经元细胞凋亡情况，用HE染色观察脊髓组织细胞形态变化。结果:脊髓损伤后7 d，模型组与假手术组比较受损脊髓组织中NF-κB和促炎性因子含量显著升高，且TUNEL凋亡率增加，芒针组大鼠受损脊髓组织中NF-κB和促炎性因子含量及TUNEL凋亡率较模型组显著降低。结论:芒针可抑制NF-κB信号通路的激活，从而降低大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织中炎性因子的表达及神经细胞凋亡的发生。

芒针;脊髓损伤;NF-κB;促炎性因子;凋亡

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是由多种不同致病因素引起的脊髓结构和功能的损害，导致损伤平面以下感觉、运动、自主神经功能改变，常导致截瘫或四肢瘫，目前尚无有效的治疗手段。现在研究认为，炎症反应和凋亡是继发性脊髓损伤的主要成分，在急性脊髓损伤的病理生理学机制中处于中心地位［1-2］。NF-κB信号通路是最基本的一条通路，当细胞受到各种胞内外刺激后，IκB激酶被激活，从而导致IκB蛋白磷酸化、泛素化，然后IκB蛋白被降解，NF-κB二聚体得到释放。核转录因子(NF-κB)是炎症相关基因表达的关键调节因子，在中枢神经系统损伤中起重要作用。芒针治疗作为一种传统中医疗法，具有疏经通络、调节平衡脏腑气血作用。脊髓损伤后针刺治疗能促进神经功能的恢复［3］。前期研究发现［4-5］，芒针能明显促进脊髓损伤后新西兰家兔神经诱发电位和运动功能的恢复。但芒针是否可以通过抑制 NF-κB通路减少炎症基因表达和神经元凋亡，促进脊髓损伤的恢复，目前尚不明确。本文建立SD大鼠脊髓急性损伤模型，探讨芒针对急性脊髓损伤后NF-κB信号通路的调节作用，了解芒针对脊髓损伤后NF-κB的激活，炎症细胞因子表达以及脊髓组织细胞凋亡的影响，探讨其神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康成年雄性 SD大鼠36只，体质量220 g～250 g，购自厦门大学动物实验中心(许可证号SYXK(闽)2013-0006)。适应性饲养1周后，将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、芒针组各12只。

1.2 主要仪器与试剂

芒针和华佗牌电针治疗仪购自苏州医疗用品厂有限公司(型号SDZ-II);酶标仪购自美国TEK-BIO仪器厂(型号Cytation3);显微镜购自麦克奥迪实业集团公司(型号BA400);病理石蜡包埋机购自沈阳市龙首电子仪器有限公司(型号LS-100);石蜡切片机购自北京弘泰嘉业科技发展有限公司(型号Finesse 325);TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB试剂盒购自美国TSZ公司;Tunel试剂盒购自罗氏生物公司;高效切片石蜡购自上海华永石蜡有限公司;蛋白酶K购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 动物模型制作

采用改良Allens法制作急性脊髓损伤模型。实验前禁食 8 h，实验顺序随机进行，各组动物采用10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)进行腹腔注射麻醉。俯卧位固定，无菌操作取胸背部正中切口，长约2.5 cm，逐层切开皮肤及皮下组织，暴露上下各1个锥体长度，咬除T9-T10棘突及全部椎板，暴露0.5 cm宽硬膜。用质量为10 g的克氏针沿带有刻度的导管从60 mm高处垂直自由下落，打击在直径4 mm、宽2 mm的由薄塑料材料制成的半圆片上，致伤后迅速移开打击物，造成大鼠脊髓后角中度损伤并逐层缝合。整个实验过程在(37±0.5)℃的温度下进行，术后4-0丝线逐层缝合，每天青霉素(80 U/d)腹腔注射预防感染，分笼饲养保持室温在20～25℃，给予充足的食物和水。每天3次膀胱按摩协助排尿，直至建立反射性膀胱排空。模型成功的判定标准，打击后损伤处脊髓出血水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。

1.4 干预方法

模型对照组造模成功后不予治疗。芒针组造模成功后，待其麻醉苏醒再进行芒针治疗。针灸穴位根据世界卫生组织制定的国际标准穴位及前期研究基础［5］进行选择:①秩边:臀外下部，股骨大转子与荐椎尾椎结合部连线外1/3与中1/3交点处;②水道:腹部，耻骨联合与胸剑联合中点连线(分13等份)耻骨联合上3等份旁开约2 cm处。针刺部位备皮消毒，不锈钢针灸针(0.35 mm直径，华佗牌)针刺至大约2 cm的深度，捻转1 min并留针15 min，并使同侧“秩边”、“水道”组成一回路连接于 JL2B型电脉冲刺激仪(苏州医疗用品厂有限公司)，治疗仪参数为频率2/100 Hz，电流1 mA，刺激15 min，电针左右隔次交替，每日1次。

1.5 脊髓组织取材

所有大鼠于损伤7 d后取材。腹腔注射水合氯醛(0.3 ml/100 mg)麻醉，经主动脉先灌注生理盐水300 ml，再灌注4%多聚甲醛(pH=7.4)200 ml固定组织，取损伤中心节段组织1cm置于4%多聚甲醛中4℃过夜。梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切取6um薄片用于ELISA法检测。待动物麻醉后于冰上迅速剪取损伤区脊髓组织(以损伤段上下各0.5 cm区域)，迅速浸入液氮5 min后转移到－80℃冰箱保存备用。

1.6 TUNEL原位末端标记法

TUNEL法按照TUNEL检测试剂盒(罗氏生物公司)说明书进行。切片二甲苯脱蜡和再水化，Proteinase K工作液处理20 min，PBS洗3次，加50 μL TUNEL反应混合液于标本上(1号试剂2号试剂以1∶14混合)，加盖玻片或封口膜暗湿盒中37℃1 h。PBS洗1次，滴加50 μL3号试剂37℃30 min，PBS洗1次，再滴加100 μL新鲜配制的 DAB工作液，显微镜下观察随时终止反应。苏木素复染，中性树胶封固。每张切片随机取5个视野计数 TUNEL阳性和阴性细胞，结果以TUNEL阳性细胞数占总细胞的百分比表示。

1.7 HE染色

脊髓损伤后7 d，各组大鼠给予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)和过量肝素生理盐水心脏灌注20 min，再用0.1 molPBS配置的4%多聚甲醛固定液(pH7.4)灌注5 min，取受损节段脊髓组织1cm石蜡包埋，切成纵向6um厚的石蜡切片，组织片二甲苯脱蜡，加入1X苏木素染液/溶性伊红染液，中性树胶封固，使用光学显微镜进行分析。

1.8 ELISA检测

取－80℃保存的脊髓组织于冰上解冻，以每克组织加入3 ml裂解液冰浴超声匀浆，4℃离心机静置20 min，3000 r/min离心20 min，吸上清液500ul，－20℃冰箱保存备用。取提取的上清液及不同浓度的标准品各孔 100 ul，根据 TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB ELISA检测试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上于450 nm波长处以阴性对照孔调零，检测各孔吸光度(OD)值，根据标准液的检测结果得出标准曲线，求出各组TNF-α、IL-6、IL-1β和NF-κB的浓度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 芒针对脊髓组织形态学的影响

假手术组可见，脊髓形态结构完整，灰质神经细胞形态正常，分布均匀，细胞膜、细胞核及组织间隙均正常，白质纤维分布均匀，髓鞘形态完整，排列整齐(见图1A1)。芒针组介于假手术组和模型组之间，可见脊髓形态结构基本完整，组织中散在血细胞，组织无水肿;灰质神经细胞形态基本正常，空泡变性减轻，部分细胞仍存在空泡变性，细胞核无明显固缩，白质纤维分布基本均匀，形态完整、无脱髓鞘(见图1C1)。模型组可见，脊髓形态不完整，神经组织残缺;组织重度出血，存在大量血细胞;组织疏松水肿、细胞空泡变性、部分细胞核固缩、神经纤维溶解、消失;灰质神经细胞数量减少，灰质神经细胞肿胀、核裂解甚至消失，细胞周围基质消失呈空泡状;白质纤维减少，分布不均匀，脱髓鞘，形态不完整且相互融合(见图1B1)。

图1 3组大鼠术后7d时病理表现和凋亡的变化

2.2 芒针对NF-κB信号通路关键因子NF-κB表达的影响

表1显示，ELISA结果显示，假手术组大鼠脊髓组织中NF-κB仅有低表达，脊髓损伤后7 d模型组大鼠脊髓组织中 NF-κB表达水平较假手术组均有升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。芒针治疗后脊髓组织中NF-κB含量较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 芒针对炎性因子 TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响

表1显示，假手术组大鼠脊髓组织中 TNF-α、IL-1β、IL-6仅有低表达，脊髓损伤后7 d，模型组大鼠脊髓组织中三者表达水平较假手术组均有升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。芒针治疗后脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.4 芒针对脊髓神经细胞凋亡的影响

图1显示，芒针治疗后脊髓病灶周围组织TUNEL染色效果，棕黄色的为凋亡细胞。假手术组因未损伤脊髓仅有少量凋亡(见图1A2)。创伤后7 d，大鼠脊髓损伤节段周围出现大量的凋亡细胞(见图1B2)，相反，经过芒针治疗后凋亡细胞数明显减少(见图1C1)。提示芒针能明显抑制神经元细胞的凋亡。术后7 d，模型组大鼠脊髓组织中神经元细胞凋亡率较假手术组增高，差异有统计学意义(P＜0.01)，芒针组大鼠脊髓组织中神经元细胞凋亡率较模型组降低，差异有统计学意义(P＜0.01，表1)。

3 讨论

芒针是由古代九针之一的长针演变而来，因其针体长、刺入深，故特别适用于可以深刺的疾病，如神经系统疾病中的神经根炎、多发性神经炎、瘫痪等，具有普通针灸无法比拟的效果［6-7］。前期发现，大鼠脊髓损伤后，1 d和3 d时芒针和普通针灸的治疗效果无明显差异，7 d时芒针的治疗效果明显优于普通针灸。故本研究以7 d作为观察点，发现芒针治疗后脊髓形态较模型组完整，促进了脊髓的修复过程。

核因子 kappa B(nuclear factor-kappaB，NF-κB)炎症信号通路是多细胞动物中决定细胞命运的一条重要通路。NF-κB信号通路可通过降解 IκBs的方式来活化，其关键因子NF-κB是细胞内重要的核转录因子，在中枢神经系统损伤中能通过调控多种基因表达而参与免疫反应、细胞凋亡与增殖及炎症反应等过程［8-9］。脊髓是神经传导的通路，脊髓原发性损伤后随之而来的继发性损伤是导致残余神经通路受损和功能丧失的重要原因［10］。脊髓损伤后的局部创伤、缺血、低氧等一系列因素导致 IKB的磷酸化，引起NF-KB的活化。本研究发现，脊髓损伤后模型组 NF-κB含量与假手术组明显增高，促进NF-κB的激活，说明NF-κB炎症信号通路参与脊髓损伤的过程。进一步研究发现，芒针治疗后抑制NF-κB的活化，说明NF-κB炎症信号通路参与芒针的治疗。

La Rosa等［11］认为，脊髓损伤后炎症反应是继发损伤的主要原因，产生典型的细胞因子有TNF-α、IL-1β、IL-6等。细胞因子主要被NF-κB在转录水平调节，其活化过程调控主要包括两条途径，一是经细胞外的正反馈途径。NF-κB活化后，可增强TNF-α和IL-lβ的基因转录，使前炎性细胞因子 TNF-α和IL-lβ产生和释放增多，TNF-α和 IL-lβ再次激活NF-κB;还可使 IL-6和 IL-8产生和释放增多，导致最初的炎症信号进一步放大［12-13］。薛奇明［14］在研究电针“足三里”穴治疗急性胰腺炎的作用机制时发现，电针“足三里”穴可以减轻牛磺胆酸钠诱导的SAP大鼠胰腺病理损伤，其机制可能与抑制NF-κB的活性、降低血清促炎因子TNF-α、IL-6浓度有关。但NF-κB信号通路是否参与芒针的炎症抑制及细胞凋亡，目前还不清楚。而王赛［15］发现，夹脊、督脉电针可以抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6等前炎性因子的表达，起到神经保护作用。本实验研究发现，急性脊髓损伤后经芒针治疗明显抑制 NF-κB的激活，且TNF-α、IL-1β、IL-6含量和神经元细胞凋亡率均明显降低。王娴［16］发现，NF-κB参与氯胺酮诱导大鼠原代培养大脑皮层神经元凋亡的过程。本研究发现，脊髓损伤后神经元细胞的凋亡率明显升高，芒针治疗后NF-κB的激活受到抑制，神经元细胞凋亡率降低，说明芒针治疗后NF-κB通路有可能参与神经元细胞的凋亡过程。

表1 各组大鼠NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及脊髓组织神经元细胞凋亡率(±s)

表1 各组大鼠NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及脊髓组织神经元细胞凋亡率(±s)

注:与假手术组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:##P＜0.01

组 别 含量NF-κB TNF-α IL-1βIL-6 凋亡率(AI)假 手 术 组 538.80±14.04 154.61±4.51 16.95±0.80 76.67±3.40 0.08±0.018模 型 组 812.43±16.33* 210.31±4.12＊＊ 23.55±0.85＊＊ 101.99±3.18＊＊ 0.95±0.025＊＊芒 针 组 623.36± 8.74## 170.26±2.92## 18.56±1.03## 86.36±1.73## 0.69±0.056##

综上所述，脊髓损伤后能促进 NF-κB的激活，进而释放大量的促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6，加重脊髓的继发性损害，导致神经元的凋亡。而芒针可能通过抑制NF-κB的激活，从而减少前炎性细胞因子的表达及抑制神经元的凋亡，促进脊髓形态的恢复。

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Effect of Elongated Needle Therapy on Acute Spinal Cord Injury and Its Relation Mechanisms

QUAN Ren-fu1，LI Chang-ming1，2，XIE Shang-ju1，YANG Zhong-bao2
(1.Xiaoshan Hospital of traditional Chinese Medicine，Hangzhou 311201，China; 2.Medical College of Xiamen University，Xiamen 361102，China)

Objective:Spinal cord injury model is created by Allen’s method，and this study is designed to explore the effect of Elongated needle therpy on the expression of proinflammatory and apoptosis in acute spinal cord injury，and to explore the relationship between NF-κB signaling pathways.Method:36 SD rats were divided into 3 groups:sham-operated group，model group and elongated needle group.The expression of TNF-α，IL-1β，IL-6 and NF-κB were detected by ELISA.Apoptosis neuron was marked with terminal deoxynucleotidyl transferase-midiated deoxyuredine triphosphate-biotin nick end labeling(TUNEL)staining.Organizational changes in cell morpholopy were observed by HE.Results:Compared with shamoperated group，the expression of NF-κB and proinflammatory in model group was markedly increased in the injuried spinal cord at 7d after injuried，and there were more TUNEL-positive cells in model group than in sham-operated group.Compared with other two groups，the rats of elongated group are lessly effected by the expression of NF-κB and Proinflammatory，and decreased the number of TUNEL-postive cells.Conclusion:Elongated needle can inhibit the activation of NF-κB signaling pathway，so that to reduce the expression of inflammatory cytokines and incidence of neural apoptosis in rats after ASCI.

Elongated needle;Spinal cord injury;NF-κB;Proinflammatory;Apoptosis.

R245.31+9

:B

:1006-3250(2016)07-0951-04

2016-01-16

浙江省中医药科研计划项目(2008CB067)-芒针对急性脊髓损伤后膀胱尿动力学及SCEP影响的研究

全仁夫(1966-)，男，浙江杭州人，教授，主任医师，医学博士，从事中医药对脊柱疾病的临床与研究。