栝楼薤白半夏汤预处理保护缺血再灌注大鼠心肌PI3K/Akt通路机制*

石月萍，杨关林

(辽宁中医药大学，沈阳 110032)

栝楼薤白半夏汤预处理保护缺血再灌注大鼠心肌PI3K/Akt通路机制*

石月萍，杨关林△

(辽宁中医药大学，沈阳 110032)

目的:研究栝楼薤白半夏汤预处理对缺血再灌注大鼠心肌组织的保护作用及其机制是否与PI3K/Akt信号通路相关。方法:40只SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、预处理组、栝楼组。模型组及栝楼组大鼠行结扎冠状动脉左前降支30 min、再灌注2 h的方法造模，并设预处理组为对照。预处理组造模方法为短暂缺血5 min、再灌注5 min，反复3次后行缺血30 min、再灌注120 min。栝楼组给予中药汤剂栝楼薤白半夏汤灌胃，其余各组灌胃同体积的生理盐水。生化自动仪检测大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、cTnT(肌钙蛋白T)含量;采用免疫组化法检测心肌凋亡相关蛋白 bax、bcl-2表达情况，采用免疫印迹法检测心肌组织的Akt、p-Akt表达。结果:栝楼组和预处理组血清CK-MB、LDH、cTnT含量及心肌组织的bax蛋白表达低于模型组，而bcl-2、p-Akt蛋白表达高于模型组。结论:栝楼薤白半夏汤预处理对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，通过激活PI3K/Akt信号通路，与调节凋亡相关基因bcl-2、bax蛋白的表达有关。

缺血再灌注损伤;栝楼薤白半夏汤;Akt;bcl-2;bax

随着冠脉介入治疗技术的广泛开展，闭塞的冠状动脉开通后血流得以重建，而随之而来的再灌注可以导致心肌的损伤。缺血预适应是减轻心肌缺血再灌注损伤最为有效的方法，近年来药物预适应已经成为防治心肌缺血再灌注损伤的研究热点［1］。目前的研究显示，许多中药的复方及单方制剂可以减轻缺血再灌注损伤［2］。栝楼薤白半夏汤［3］、枳实薤白桂枝汤［4］以及以枳实薤白桂枝汤加减的温阳通脉方，均可以减轻心肌缺血再灌注损伤［5］，并通过多种机制发挥心肌保护作用［6-7］。多条信号通路参与缺血再灌注损伤机制，其中RISK途径的PI3K/ Akt通路参与缺血及药物预处理及后处理对再灌注损伤的保护作用［8］。栝楼薤白半夏汤的心肌保护作用，是否与PI3K/Akt通路调节 bax、bcl-2相关尚无报道。本研究拟观察栝楼薤白半夏汤是否通过PI3K/Akt调节心肌细胞凋亡相关基因bax、bcl-2机制参与心肌再灌注损伤的保护。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

40只雄性SD大鼠，体质量250～300 g，购于辽宁医学院实验雄性动物中心，按照随机数字表法分为假手术组、模型组、预处理组、栝楼组(栝楼薤白半夏汤)4组各10只。

1.2 药品与试剂

栝楼薤白半夏汤方由栝楼、薤白、半夏等组成，采用免煎配方颗粒，北京康仁堂药业有限公司提供(批号14006951)。肌酸激酶同工酶检测试剂盒、乳酸脱氢酶检测试剂盒、肌钙蛋白定量检测试剂盒购于德国罗氏诊断有限公司;Rabbit anti-Akt，Rabbit anti-p-Akt，Bcl-2、Bax单克隆抗体，山羊抗兔 IgG抗体购于北京博奥森生物技术有限公司;BCA蛋白测定试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司;DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。

1.3 实验仪器

小动物呼吸机(DH150)由浙江大学医学仪器厂生产;监护仪(BSM-7105)光电医用电子公司生产;全自动生化分析仪(HITACHI7080)购于日本HITACHI7080公司;超薄切片机(EMC6型)购于LEICA公司;全自动免疫组化染色仪购于美国DAKOCYTOMSTION;光学显微镜购于日本奥林帕斯;TGL-16G低温冷冻离心机购于日本日立公司;垂直电泳槽(HE-180)、转移电泳槽购于上海天能科技有限公司。

1.4 模型制备及给药

按照文献方法采用左前降支结扎的方法制备模型［9］，采用腹腔注射乌拉坦(1 g/kg)麻醉大鼠，将麻醉后的大鼠仰卧固定于小动物解剖台固定四肢，插入针形电极，连接好心电图监测仪，全程记录Ⅱ导心电图。筛选正常心电图的大鼠进行气管插管操作，连接小动物呼吸机，进行人工机械通气。胸部皮肤消毒备皮，用手术剪刀从左侧胸部剪开皮肤分离胸部肌肉，第四肋处剪开胸腔暴露心脏，剪开心包膜，在左心耳部下方约2 mm处穿进6-0带线缝合针，穿过心肌表层，在肺动脉圆锥的旁边出针，将直径1.5 mm的硅胶管放在结扎线与冠状动脉左前降支血管之间。系紧结扎线时，左前降支血管受到硅胶管压迫而致冠状动脉闭塞，松开结扎线时血管再通。模型组、GL组结扎30 min，松开结扎线以使血流开通120 min。预处理组结扎左前降支5 min，松开结扎线，再灌注 5 min，此种方式重复3次，再进行缺血30 min，再灌注120 min。假手术组只进行开胸，并在冠状动脉处完成穿线，但不结扎冠状动脉。

模型制备前栝楼组灌胃栝楼薤白半夏汤 1.5 ml/d免煎中药配方颗粒(栝楼薤白半夏汤配伍比例为4∶3∶3，2.7 g/kg)，其他组灌胃生理盐水1.5 ml/d连续2周。缺血再灌注损伤模型成功的标志为左前降支结扎后可见左心室颜色发绀，心电图S-T段抬高。再灌注血流后，心肌颜色由发绀转红，伴有心律失常发生。

1.5 指标检测

1.5.1 血清心肌酶学检测 实验完成后大鼠无死亡，再灌注120 min后左心室取血，采用生化分析仪酶比色法检测CK-MB、LDH、cTnT。

1.5.2 心肌组织 p-Akt蛋白检测 采用免疫印迹法检测p-Akt蛋白含量。取缺血区心肌组织称取100 mg，加入1 ml裂解液，匀浆器置冰上研磨组织，匀浆后12000 r/min、4℃离心10 min，吸取上清液，BCA试剂盒测定蛋白含量，蛋白变性，上样，电泳、转膜，含5%脱脂奶粉的 TBS中37℃封闭120 min，加一抗4℃封闭过夜，TBS-T液洗涤3次，加二抗37℃孵育120 min，TBS-T洗涤3次后滤干，暗室内加入发光液后曝光30 min，扫描图像分析各组蛋白的相对光密度值。

1.5.3 心肌组织bax、bcl-2检测 采用免疫组织化学法检测。造模后取缺血部位心肌组织，4%多聚甲醛固定制作石蜡切片。心肌组织蜡片经6 h温箱烤片，常规脱蜡，PBS液冲洗3次。切片置枸橼酸盐缓冲液中，140℃微波加热5 min，待冷却后再次冲洗。用3%的过氧化氢孵育5 min冲洗，加入1∶100稀释的 bax、bcl-2一抗，湿盒内4℃冰箱内过夜，冲洗后的切片再加入生物素标记的二抗，37℃孵育，20 min后冲洗DAB显色3～5 min。再水洗经苏木素复染，酒精脱水后二甲苯透明，树脂封片后显微镜下观察Bcl-2、Bax蛋白表达。细胞浆染成棕黄色的细胞为阳性细胞，计算阳性细胞核数与细胞核总数比值。

1.6 统计学方法

采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，各组数据以均数±标准差(±s)表示，计量资料采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌酶学及心肌组织p-Akt、bax、bcl-2表达(表1)

表1 大鼠血清CK-MB、LDH、cTnT含量及心肌p-Akt、bax、bcl-2的表达(±s)

表1 大鼠血清CK-MB、LDH、cTnT含量及心肌p-Akt、bax、bcl-2的表达(±s)

注:与假手术组比较:△P＜0.05;与模型组比较:☆P＜0.05

p-Akt bax bcl-2假手术组 10 555.70±101.92 368.94± 72.17 1.37±0.20 0.5组 别 鼠数 CK-MB(U/L) LDH(U/L) cTnT(μg/L) 2±0.12 0.21±0.08 0.25±0.07模 型 组 10 1902.44±256.21△ 1483.93±208.91△ 8.85±2.50△ 0.68±0.14△ 0.79±0.13△ 0.41±0.09△预处理组 10 1473.07±158.26△☆ 1185.59±107.60△☆ 5.25±1.65△☆ 1.14±0.17△☆ 0.35±0.09△☆ 0.65±0.11△☆栝 楼 组 10 1508.95±175.53△☆ 1171.47±127.43△☆ 5.15±1.58△☆ 1.22±0.27△☆ 0.36±0.10△☆ 0.66±0.14△☆

2.2 各组大鼠心肌组织p-Akt表达(图1)

2.3 大鼠心肌组织bax、bcl-2蛋白表达

图1 各组大鼠心肌组织p-Akt表达

图2 各组大鼠心肌bax表达(×400)

图2 显示，与假手术组比较，模型组心肌细胞Bax表达明显增多，预处理组及栝楼组 Bax表达有所减少。

图3 各组大鼠心肌Bcl-2表达(×400)

图3 显示，与假手术组比较，模型组心肌细胞Bcl-2表达明显减少，预处理组及栝楼组Bax表达有所增加。

3 讨论

冠脉介入治疗时出现的心肌缺血再灌注损伤证候应类似于中医学的“胸痹心痛”。栝楼薤白半夏汤方为《金匮要略》治疗胸痹心痛的方剂，具有行气化痰、宣痹通阳的功效。临床实践及实验研究均表明，栝楼薤白半夏汤具有心脏保护作用［3］。

研究表明，冠脉介入治疗后，血管开通伴随的心肌缺血再灌注损伤的机制包括氧化应激、钙超载、炎症损伤、细胞凋亡等。动物实验观察到，缺血预适应是心肌缺血再灌注损伤最重要也是最为有效的内源性保护机制［9］。线粒体途径为凋亡机制之一［10］，其中PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)/Akt(蛋白激酶B)通路为缺血再灌注损伤的主要抗凋亡通路，Akt被认为是复杂网络信号通路的中心调节器。Bcl-2为Akt底物之一，Bcl-2能与线粒体上的特异位点相结合，抑制线粒体细胞色素C释放，降低Caspase-3活性，抑制细胞凋亡［11-12］。

中药单方复方对心肌缺血再灌注损伤的保护作用已有报道，但是否具有药理性预适应样作用以及具体的保护机制尚不明确［13］。

本实验观察了栝楼薤白半夏汤预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌坏死标记物CK-MB、LDH、cTnT含量与 PI3k/Akt及其下游抗凋亡分子 bax、Bcl-2的影响。研究结果显示，模型组的 CK-MB、LDH、cTnT明显高于假手术组，说明缺血再灌注损伤模型成功。与模型组比较，预处理组和栝楼组的CK-MB、LDH、cTnT均明显下降，说明预处理和栝楼薤白半夏汤对缺血再灌注损伤均具有保护作用。

观察到栝楼组及预处理组大鼠心肌组织中bcl-2蛋白表达水平明显增加，bax蛋白表达减少，说明栝楼薤白半夏汤与心肌缺血预适应均可明显抑制心肌缺血再灌注后心肌组织中bax蛋白的表达，上调Bcl-2表达。免疫印迹方法检测各组Akt、p-akt的结果显示，各组akt表达量无差异，而p-Akt的表达各组有差异，表明 p-Akt的变化是缺血再灌注损伤及栝楼薤白半夏汤的作用靶点。假手术组仅有少量p-akt表达，模型组略有升高，说明机体受到缺血刺激后p-akt表达增加。预处理组 p-akt表达明显增加，说明预处理可激发Akt磷酸化发挥调节作用;栝楼组及预处理组p-akt表达明显增多，2组之间比较差异无统计学意义，说明栝楼薤白半夏汤能够通过Akt磷酸化发挥心肌保护作用，与心肌缺血预适应的作用类似。以上结果说明，预处理组通过缺血前的预处理使p-Akt、bcl-2蛋白表达增加，而栝楼薤白半夏汤通过模拟心肌缺血预适应上调 p-Akt、bcl-2表达发挥心肌保护作用。

本研究结果表明，栝楼薤白半夏汤能够降低心肌坏死标记物的含量，上调心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞p-Akt、bcl-2，降低bax蛋白表达，说明栝楼薤白半夏汤对大鼠急性心肌缺血引起的心肌损伤具有保护作用，其机制可能与预适应样作用通过 PI3K/ Akt途径上调bcl-2、抑制bax蛋白表达有关。

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Evaluation Research of Saliva Collection Method in Rat Model of Spleen Deficiency by Using Salivary Amylase Activity Index

SHI Yue-ping，YANG Guan-lin△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，liaoning，Shenyang，110032，China)

Objective:To study the effects of Gualou Xiebai Banxia Decoction on rats with myocardial ischemia/ reperfusion injury and PI3K/Akt mechanism.Methods:Forty male SD rats were randomly divided into sham operation group，model(ischemia reperfusion)group，ischemia preconditioning group，Gualou Xiebai Banxia decoction(Gualou) group.The model group were established by ligation of LAD 30 minutes and 120 minutes reperfusion.Gualou group were established by ischemia reperfusion model and previous three 5 minutes ischemia and 5 minutes reperfusion.Creatine kinase MB Isoenzyme(CK-MB)，lactate dehydrogenase(LDH)and Troponin T(cTnT)in serum were measured.The expression of the bax and bcl-2 was tested by immunohistochemistry method.The expression of Akt was tested by Western blot method.Results:The serum level of CK-MB，LDH，cTnT and bax in myocardium of ischemia preconditioning and GuaLou group were lower than model group，but higher than sham group.The expression level of Akt and bcl-2 in myocardium ischemia preconditioning and GuaLou group were higher than IR group.Conclusion:Gualou Xiebai Banxia decoction preconditioning can protect ischemia reperfusion rats by uploading the expression of bcl-2 and download the expression of bax via PI3K/Akt signal pathway.

Myocardial ischemic reperfusion;Ischemic preconditioning;Gualou Xiebai Banxia decoction;Akt;Bcl-2;Bax

R285.5

:B

:1006-3250(2016)07-0906-03

2016-01-27

辽宁省自然科学基金资助项目(201102128)-温阳通脉法保护心肌缺血再灌注大鼠RISK通路机制

石月萍(1968-)，女，辽宁鞍山人，主任医师，教授，医学硕士，从事中医药防治心血管疾病的临床与研究。

△通讯作者:杨关林，教授，博士研究生导师，Tel:024-31207046，E-mail:yang_guanlin@163.com。