肝主疏泄功能对模型动物SRBⅠ基因mRNA表达的影响*

郭正阳，倪祥惠，赵 博，黄 聪，吴大梅，吴 菁，林川烘，潘雷文

(贵阳中医学院，贵阳 550002)

肝主疏泄功能对模型动物SRBⅠ基因mRNA表达的影响*

郭正阳，倪祥惠△，赵 博，黄 聪，吴大梅，吴 菁，林川烘，潘雷文

(贵阳中医学院，贵阳 550002)

目的:观察肝主疏泄功能对模型动物肝脏SRBⅠ基因mRNA表达的影响。方法:将健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常组、CUMS组和单纯束缚组，采用孤养结合CUMS以及单纯束缚造模方法建立肝失疏泄动物模型，实时荧光定量TaqMan探针法检测肝脏组织内SRBⅠ基因mRNA的表达量并观察其变化规律。结果:与正常组比较，CUMS组和单纯束缚组大鼠肝脏SRBⅠ基因mRNA的表达量均增高。结论:肝主疏泄功能的失常会在一定程度上影响模型动物SRBⅠ基因的表达，在某种肝失疏泄状态下SRBⅠ基因的mRNA表达呈升高趋势。

肝主疏泄;慢性轻度不可预见性应激;单纯束缚应激;胆固醇性胆结石;SRBⅠ基因

胆固醇性胆结石是一种严重危害人类健康的常见病与多发病。现代医学研究发现，胆固醇性胆结石形成的首要原因是肝脏胆固醇代谢异常引起的胆汁中胆固醇过饱和，且与遗传因素密切相关。胆固醇性胆结石属于中医学“胆胀”“胁痛”“腹痛”“黄疸”等范畴，其发病主要与肝的疏泄功能有关。本文以孤养结合 CUMS(慢性轻度不可预见性应激，chronic unpredictable mild stress)以及单纯束缚为造模方法，模拟肝失疏泄的动物模型，从SRBⅠ基因入手，观察肝主疏泄功能对SRBⅠ基因mRNA表达的影响，为“胆病从肝论治”提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

6周龄SPF级雄性SD大鼠36只，体质量170 g～190 g，购于解放军第三军医大学实验动物中心(许可证号SCXK-(军)2012-0003)。

1.2 试剂

RNA抽提试剂盒(批号 CW0581)由北京康为世纪生物科技有限公司提供;反转录试剂盒(批号4368814)、TaqMan®Universal Master MixⅡ，no UNG、2X(批号4428174)、SRBⅠ基因(1201313)以及管家基因Gapdh(1239726)均由applied biosystems公司提供。

1.3 仪器

ABI7500实时荧光PCR仪、eppendorf台式高速冷冻离心机(5810R)、超微量核酸蛋白检测仪(Thermo Scientific)、电动匀浆机、酶标仪、恒温水浴锅、－80℃冰箱。

1.4 动物分组

实验大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法分为正常组、CUMS组和单纯束缚组3组各12只。

1.5 孤养结合CUMS模型的复制

每只CUMS组大鼠均进行单笼孤养。CUMS模型的制备在金光亮等［1］提出的造模方法基础上根据自身实际情况进行操作，将7种刺激(4℃冷水游泳5 min;45℃热刺激5 min;12 h禁水;24 h禁食;12 h昼夜颠倒;行为限制;45 min无规则水平摇晃)随机安排在21 d内，每天随机2种，并保证相邻2 d不重复同一种刺激。本组动物于造模开始第2天意外死亡3只，将正常组动物补入CUMS组3只。

1.6 单纯束缚模型的复制

参考黄聪等［2］文献中提到的造模方法，使用鼠笼加报纸填塞法限制大鼠活动(3 h/d)。

1.7 标本采集

所有动物于造模后第22天用10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g进行腹腔麻醉，将麻醉好的大鼠固定于鼠板上沿腹正中线切开，在剑突下方找到肝脏，取适量样本在0.9%氯化钠溶液中漂洗去除血污，分装放入冻存管内并加入适量RNA保存液，然后将所取的样本放于－80℃冰箱中保存待测。

1.8 实时荧光定量 TaqMan探针法检测肝脏SRBⅠ基因mRNA的表达

取30～50 mg肝脏组织严格按照试剂盒说明提取总RNA。在超微量核酸蛋白检测仪上检测样品RNA含量并进行反转录合成 cDNA。PCR扩增: TaqMan®Universal Master MixⅡ 10 μL，TaqMan®Assay 1 μL，样本 cDNA 1 μL，RNase-Free water 8 μL。扩增条件:95℃ 10 min;95℃ 10 s，60℃ 1 min，40个循环，反应结束后以2－△△CT值计算SRBⅠ基因mRNA的表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，各组数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1显示，CUMS组和单纯束缚组肝脏SRBⅠ基因 mRNA的表达量均较正常组表达量增高，且CUMS组与正常组、CUMS组与束缚组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，但单纯束缚组与正常组之间比较差异无统计学意义。

表1 大鼠肝脏组织SRBⅠ基因表达量(±s)

表1 大鼠肝脏组织SRBⅠ基因表达量(±s)

注:与正常组比较:※P＜0.05;与CUMS组比较:○P＜0.05

组别 例数 2－△△CT值0.6506±0.3209 CUMS 组 12 1.3849±0.6949※单 纯 束 缚 组 12 0.7641±0.6081正 常 组9○

3 讨论

中医藏象理论认为，肝具有主疏泄的生理功能，是指肝气具有疏通、畅达全身气机进而调节精血津液运行输布、脾胃之气升降、胆汁分泌排泄以及情志舒畅等作用。其中促进胆汁的分泌排泄是肝疏泄功能之调节脾胃正常消化功能的主要表现之一。肝与胆在组织结构上直接相连通，又有经脉互为络属，为表里相合之脏腑。胆为“中精之腑”，内藏精汁即胆汁，胆汁实为肝之余气所化生，其排泄亦依赖于肝的疏泄功能。肝的疏泄功能正常、气机通畅，则胆汁才能正常的分泌和排泄，反之则会影响到胆汁的正常分泌与排泄，导致胆汁郁滞进而影响食物的消化吸收，若胆汁郁滞日久则易生结石。而孤养结合CUMS造模法和单纯束缚造模法是目前常用的情志疾病造模方法，并在一定程度上能够影响肝的疏泄功能。

胆汁中胆固醇过饱和是胆固醇性胆结石形成的首要原因。倪祥惠等［3］研究表明，通过孤养结合CUMS和单纯束缚的造模方法所模拟的肝失疏泄动物模型，能使胆汁中的胆固醇浓度明显升高。而SRBⅠ(B组Ⅰ型清道夫受体，the scavenger receptor class B typeⅠ)基因作为细胞表面惟一的高密度脂蛋白受体［4］，可以通过选择性摄取胆固醇和胆固醇脂，使胆固醇从血浆高密度脂蛋白中通过肝脏进入胆汁，是形成胆汁中胆固醇的重要来源。有研究［5］显示，SRBⅠ基因mRNA的表达与胆固醇性胆结石的形成密切相关。该研究认为，若肝脏过度表达SRBⅠ基因，会使血浆高密度脂蛋白中的胆固醇通过SRBⅠ被肝脏摄取而进入胆汁，导致血浆HDL胆固醇含量降低，胆汁中胆固醇浓度增加，将大大增加结石的形成几率。

本实验结果表明，与正常组比较，CUMS组和单纯束缚组模型动物肝脏SRBⅠ基因mRNA的表达量均升高，其中CUMS组显著升高，而单纯束缚组相对升高不明显，造成这一差异的原因可能是由于孤养结合CUMS和单纯束缚这2种造模方法造成肝失疏泄状态的差异所引起。因此，这在一定程度上说明肝的疏泄功能失常能够影响到肝脏中SRBⅠ基因mRNA的表达并使其升高，是形成胆固醇性胆结石的重要因素之一，这也为胆固醇性胆结石疾病选择“胆病从肝论治”提供了一定的实验依据。但肝的疏泄功能失常所造成SRBⅠ基因mRNA过度表达的具体发生机制，还有待于今后的进一步深入研究。

［1］金光亮，南睿，郭霞珍.慢性应激肝郁大鼠模型的建立［J］.北京中医药大学学报，2003，26(2):18-21.

［2］黄聪，倪祥惠，曹峰，等.几种肝郁动物造模方法比较及鼠笼加报纸固定束缚法的效果观察［J］.中国中医基础医学杂志，2014，20(11):1485-1486.

［3］倪祥惠，赵博，曹峰，等.肝主疏泄对模型动物胆固醇浓度的影响［J］.江西中医药，2014，45(11):21-22.

［4］洪智贤，何小东.胆囊结石成因研究进展［J］.消化外科，2006，5(6):479-482.

［5］Kosters A，Jirsa M，Groen AK.Genetic background of cholesterol gallstone disease［J］.Biochim Biophys Acta，2003，1637(1):1-19.

Effect of Liver Controlling Dispersion on the Expression of SRBⅠGene mRNA in the Animal Model

GUO Zheng-yang，NI Xiang-hui△，ZHAO Bo，HUANG Cong，WU Da-mei，WU Jing，LIN Chuan-hong，PAN Lei-wen
(Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China)

Objective:The effects of Liver controlling dispersion on the model animal’s gene expression in mRNA of SRBⅠdiscussed through the observation of change of the model animal’s mRNA expression of SRBⅠunder Liver not freely distributing conditions.Methods:We select healthy male SD Rats and divide as Normal group，Chronic Unpredictable Mild Stress(CUMS)group and Chronic Restraint Stress(CRS)group.Then we use raising alone combining CUMS and CRS method making model to stimulate SD Rats，and then take the liver tissue to detect the gene expression of SRBⅠ by Real-Time TaqMan PCR，so as to observe their change law.Results:Compared with normal group，the gene expression of SRBⅠ of CUMS group and CRS group had increased.Conclusion:When the function of Liver controlling dispersion is abnormal，it can affect the model animal’s gene expression in mRNA of SRBⅠ in certain cases.Besides，the gene expression in mRNA of SRBⅠ can tend to increase under some not Liver freely distributing conditions.

Liver controlling dispersion;Chronic unpredictable mild stress;Chronic restraint stress;Cholesterol gallstone;SRBⅠgene

R223

:B

:1006-3250(2016)07-0904-02

2016-01-06

国家自然科学基金资助项目(81160418)-肝主疏泄功能对模型动物胆汁胆固醇浓度、总胆汁酸浓度和 BSEP、SRBⅠ基因表达的影响;贵州省科技厅、贵阳中医学院联合基金资助项目(黔科合中药字［2010］LKZ7015号)-肝主疏泄功能对模型大鼠胆汁中胆固醇浓度的影响

郭正阳(1990-)，男，河南许昌人，医学硕士，从事中医基础理论研究。

△通讯作者:倪祥惠(1968-)，男，山东滕州人，教授，医学硕士，硕士研究生导师，从事中医基础理论的教学、科研与临床研究，Tel:13608567815，E-mail:plkmnxh@163.com。