红景天口服液对大鼠心肌细胞缺氧耐受性的影响研究

姚卓贤，冯 凯

（江苏省常州市第一人民医院，江苏 常州 213001）

红景天口服液对大鼠心肌细胞缺氧耐受性的影响研究

姚卓贤，冯 凯

（江苏省常州市第一人民医院，江苏 常州 213001）

目的 观察红景天口服液对大鼠心肌细胞缺氧耐受性的改善作用。方法 将40只雄性SD大鼠乳鼠，按体重随机分为溶剂对照组、模型对照组、阳性对照组和红景天组。溶剂对照组和模型对照组给予生理盐水20 L／mL，阳性对照组给予氟桂嗪胶囊20 g／mL，红景天组给予红景天口服液20 L／mL。大鼠心肌细胞提取后常规培养10 d，更换不含胎牛血清的DMEM培养基，溶剂对照组在正常环境的培养箱中培养；模型对照组、阳性对照组和红景天组心肌细胞放入温度为37℃及CO2浓度为5%、O2浓度为1%的三气培养箱中进行缺氧处理，缺氧时间为6 h。缺氧后收集细胞培养上清液，按试剂盒的要求分别测试乳酸脱氢酶、丙二醛、肌酸激酶、超氧化物歧化酶的水平。取余下细胞，按凯基细胞凋亡检测试剂盒的要求用流式细胞仪测试细胞凋亡的情况，用MTT法测试心肌细胞的活力水平。结果 红景天口服液能显著提高大鼠原代培养心肌细胞在缺氧条件下的活力，减少细胞凋亡，效果优于阳性对照药（P＜0．01）；并且可降低原代培养心肌细胞因缺氧所致心肌酶升高，有较好的清除氧自由基作用和对缺氧心肌细胞的保护作用，效果优于阳性对照药(P＜0．01)。结论 红景天口服液可明显提高大鼠心肌细胞的缺氧耐受性，为临床治疗缺氧性心肌病提供理论依据及实验资料。

红景天口服液；大鼠；心肌细胞；缺氧；耐受性

红景天(Rhodiola rosea)为景天科多年生草木或灌木植物，生长在海拔800～2 500 m高寒无污染地带的珍稀野生植物。20世纪60年代苏联科学家发现，它具有适应原样作用，可协助身体回复稳态，加强机体适应性，增强机体对物理、化学和生物学等各种有害刺激与损伤的非特异性抵抗力，使紊乱的机能恢复正常。现代药理研究表明[1]，红景天具有抗缺氧、抗菌、抗氧化、提高免疫力等作用。为此，笔者观察了红景天口服液对大鼠心肌细胞缺氧耐受性的改善作用，旨在为临床治疗缺氧性心肌病提供理论依据及实验资料。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

药品与试剂：高山红景天口服液（杭州华威药业有限公司，批号为140701，规格为每支10 mL）；盐酸氟桂利嗪胶囊（西安杨森制药有限公司，批号为150306692，规格为每粒5 mg）；氯胰酶（Gibco公司分装）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所，每瓶200 mL），5－Brud（sigma公司，上海浩然生物技术有限公司分装，每瓶500 mg）；噻唑蓝（MTT，AMRESCO 公司，批号为LJ0628A5010J）。乳酸脱氢酶(LDH)测试盒（南京建成生物工程研究所，批号为20130807）；丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号为20130731）；肌酸激酶（CK）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号为20131031）；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号为 20130813）；凯基 Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号为20130709）。

动物：雄性ICR清洁级大鼠乳鼠，由苏州大学动物房提供。

仪器：MCO－15AC型CO2恒温培养箱（SANYO公司），3131型三气培养箱（Thermo Fisher Scientific公司），BCM－1000A型生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），L－500型低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），multiskan MK3型酶标仪（赛默飞世尔＜上海＞仪器有限公司），FACSCalibur型流式细胞仪（BD公司），电子计时器，1 mL注射器，密封广口瓶。

1．2 方法

1．2．1 试验分组与给药

取雄性SD大鼠乳鼠40只，单笼喂养3 d后，按体重随机分为溶剂对照组、模型对照组、阳性对照组和红景天组。提取心肌细胞，溶剂对照组和模型对照组给予生理盐水20 μL／mL，阳性对照组给予氟桂嗪胶囊20 μg／mL，红景天组给予红景天口服液20 μL／mL，正常环境培养10 d。

1．2．2 试验方法

取2～3日龄SD大鼠乳鼠，放入75%酒精中浸泡消毒1 min，取出后开胸取心脏放入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS液)中。将心脏剪成1 mm×1 mm×1 mm小碎块，并用PBS液反复洗涤。取用2．0 g／L的胰蛋白酶10 mL，37℃消化10 min，加入1 mL胎牛血清终止消化，200目网筛滤过，2 000 r／min离心取沉淀后用含 10%FBS、10%胎牛血清、1%青链霉素及0．1 mmol／L 5－Brud的 DMEM培养基接种于培养瓶中。37℃及5%的CO2、饱和湿度下培养贴壁1．0 h，收集未贴壁细胞，即为纯度较高的心肌细胞。离心，计数后随机接种在24孔板中，放在CO2恒温培养箱中培养[2－4]。

心肌细胞常规培养10 d后，更换不含胎牛血清的DMEM培养基，溶剂对照组在正常环境的培养箱中培养。模型对照组、阳性对照组和红景天组心肌胞放入温度为37℃及CO2浓度为5%、O2浓度为1%的三气培养箱中进行缺氧处理，缺氧时间为6 h。缺氧后收集细胞培养上清液，按试剂盒的要求分别测试LDH，MDA，CK，SOD的水平。取余下细胞，按凯基细胞凋亡检测试剂盒的要求用流式细胞仪测试细胞凋亡的情况，用MTT法测试心肌细胞的活力水平。

1．2．3 检测指标

细胞凋亡指数、细胞活力、细胞上清液酶学指标(LDH，MDA，CK，SOD)。

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 对原代缺氧培养大鼠心肌细胞活力的影响

用MTT法检测细胞活力发现，未经缺氧培养的大鼠心肌细胞(溶剂对照组)活力为0．923%，经过缺氧培养的大鼠心肌细胞(模型对照组)活力为0．303%，显著低于未经缺氧的溶剂对照组(P＜0．05)，说明缺氧对培养心肌细胞活力有较大影响。阳性对照组和红景天组心肌细胞的活力分别为0．359%和0．487%，说明红景天口服液能提高缺氧培养的大鼠原代心肌细胞活力，与模型对照组比较心肌细胞活力升高非常显著(P＜0．01)，效果优于阳性对照组。见表1。

表1 红景天口服液口服对缺氧培养大鼠原代心肌细胞活力的影响(s，n＝10)

表1 红景天口服液口服对缺氧培养大鼠原代心肌细胞活力的影响(s，n＝10)

注：与模型对照组比较， P＜0．05，＃P＜0．01。下表同。

组别溶剂对照组模型对照组阳性对照组红景天组剂量( g／mL) 20 20细胞活力(%) 0．923±0．022 0．303±0．011 0．359±0．008 0．487±0．007＃

2．2 对原代缺氧培养大鼠心肌细胞凋亡的影响

对原代培养的大鼠心肌细胞经过凋亡检测试剂盒处理后，用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果发现，溶剂对照组细胞凋亡指数为7．11%，模型对照组细胞凋亡指数为18．2%，阳性对照组和红景天组分别为13．5%和12．3%，说明红景天口服液能降低缺氧培养的大鼠原代心肌细胞凋亡指数，与模型对照组比较心肌细胞凋亡指数下降非常显著(P＜0．01)，效果优于阳性对照组。见表2。

表2 红景天口服液对缺氧培养大鼠原代心肌细胞凋亡的影响(s，n＝10)

表2 红景天口服液对缺氧培养大鼠原代心肌细胞凋亡的影响(s，n＝10)

组别溶剂对照组模型对照组阳性对照组红景天组剂量( g／mL) 20 20凋亡指数(%) 7．11±0．55 18．2±3．13 13．5±2．65 12．3±1．23＃

2．3 对原代缺氧培养大鼠心肌细胞上清液酶的影响

LDH与CK：模型对照组与溶剂对照组相比，LDH与CK显著增加，说明常压缺氧环境下对心肌细胞造成了严重的损伤。与模型对照组比较，阳性对照组和红景天组的LDH和CK均有不同程度的降低，以LDH为例，模型对照组为1 544 U／L，阳性对照组为1 088 U／L，红景天组为855 U／L，说明红景天口服液对保护缺氧心肌细胞、减轻因细胞坏死造成心肌酶的溢出有较好的保护作用。见表3。

表3 红景天口服液对原代缺氧培养大鼠心肌细胞酶学的影响(s，n＝10)

表3 红景天口服液对原代缺氧培养大鼠心肌细胞酶学的影响(s，n＝10)

组别酶指标溶剂对照组模型对照组阳性对照组红景天组LDH（U／L）622±188 1 544±323 1 088±345 855±238＃CK（U／mL）0．39±0．16 1．42±0．55 0．91±0．42 0．88±0．34＃MDA（nmol／mL）0．58±0．31 2．75±1．03 2．02±0．34 1．83±0．55＃SOD（U／mL）17．0±0．73 6．23±2．13 10．1±2．21 11．5±1．97

MDA与SOD：模型对照组与溶剂对照组相比，MDA含量显著上升，SOD含量显著下降，说明缺氧导致心肌细胞脂质过氧化，产生大量的脂质过氧化物，SOD的活性受到抑制。与模型对照组比较，阳性对照组和红景天组培养细胞上清液中MDA浓度降低，SOD含量升高，说明红景天口服液对培养心肌细胞缺氧引起的氧化应激有较好的保护作用。见表3。

3 讨论

氧对维持机体生命活动十分重要，缺氧可对机体造成多方面的损害：首先将对中枢神经造成损伤，导致脑水肿甚至神经元不可逆坏死；导致心功能降低，微循环障碍，最终导致全身重要脏器的供血不足；还将产生大量的自由基，导致细胞功能严重受损，引发细胞凋亡。因此，提高缺氧耐受力，能有效保护缺氧损伤。

相关药理学研究已证实，红景天具有明显改善心肌缺血缺氧、降低心肌耗氧量、保护损伤心肌等作用[5]。龙怡等[6]通过体外缺氧缺糖心肌细胞损伤模型，分别测定细胞MTT，LDH和MDA的变化，观察红景天单体成分红景天苷、酪醇、没食子酸、德钦红景天苷、草质素－7－O－(3′－β－D－葡萄糖)－α－L－鼠李糖苷5种成分对心肌细胞损伤的保护作用，结果显示，5种单体成分均有不同程度的促细胞活力，降低LDA和MDA的含量，其中单体成分红景天苷、酪醇能明显上调HIF－1α mRNA的表达。表明红景天有明显抗缺氧作用，5种单体成分对缺氧缺糖心肌细胞损伤具有明显的保护作用，其机制与上调HIF－1αmRNA的表达相关。

本研究通过大鼠乳鼠心肌细胞缺氧培养试验，分别从细胞水平和分子水平证实了红景天口服液能提高大鼠乳鼠心肌细胞的缺氧耐受性。红景天组可显著增加缺氧心肌细胞的细胞活力，降低心肌细胞的细胞凋亡，且效果优于阳性对照组选择的西药氟桂利嗪；红景天组能显著降低CK，LDH的表达及MDA浓度，提高SOD表达，表明红景天口服液能显著降低氧化应激引发的脂质过氧化程度，具有显著的缺氧心肌损伤的保护作用。故可认为，红景天口服液提高缺氧耐受力的作用机制与降低脂质过氧化、保护缺氧心肌细胞损伤有关。

综上所述，红景天口服液能显著提高大鼠原代培养心肌细胞在缺氧条件下的活力，减少细胞凋亡；并且能降低原代培养心肌细胞因缺氧所致心肌酶的升高，有较好的清除氧自由基的作用，显示出对缺氧心肌细胞较好的保护作用。

[1]滕静如，熊佳鹏，肖 诚，等．红景天的现代药理学研究进展[J]．中国中医基础医学杂志，2006，12（4）：319－320．

[2]郝 然，娄金丽，张允岭，等．参麦注射液对缺氧心肌细胞凋亡的影响[J]．中国病理生理杂志，2007，23（4）：660－663．

[3]余 伟，王 伟，陈纯娟，等．白黎芦醇对大鼠缺氧心肌细胞凋亡的保护作用及对SIRTI表达的影响[J]．中国老年心脑血管病杂志，2009，11（5）：365－368．

[4]李雪莲，关会林，王 璐，等．丹参酮ⅡA调剂 microRNA－1保护缺氧心肌的作用[J]．现代生物医学进展，2014，28（14）：5 463－5 466．

[5]王秋爽．大株红景天注射液治疗稳定型心绞痛的疗效观察[J]．中国保健营养，2013，23（8）:4 606．

[6]龙 怡，李佳川，孟宪丽．红景天有效成分对缺氧缺糖心肌细胞损伤的保护作用研究[J]．中药药理与临床，2010，26（1）：24－26．

Influence of Rhodiola Rosea Oral Liquid on the Hypoxia Tolerance of Rat Myocardial Cell

Yao Zhuoxian,Feng Kai
(Changzhou First People′s Hospital,Changzhou,Jiangsu,China 213001)

Objective To investigate the improvement of hypoxia tolerance of rat myocardial cells by Rhodiola rosea Oral Liquid．M ethods 40 male SD neonate rats were randomly distributed into 4 groups by their weights:solvent control group,model group,positive control group and the experimental group．The solvent group and the model group were treated with physiological saline(20 μL／mL), while the positive control group was treated with physiological saline capsule(20 μg／mL)and the experimental group with oral liquid of Rhodiola rosea(20 μL／mL)．The rat myocardial cells were cultured for 10 d in DMEM medium without fetal bovine serum．The solvent control group was cultured in incubator with normal conditions．The model group,positive control group and the experimental group were cultured in tri－gas incubat with 5% CO2and 1% O2at 37℃ for 6 h．Afterward,cell culture supernatant was harvested and analyzed through a number of assays．Based on the kit instruction,the levels of lactate dehydrogenase,malonaldehyde,creatine kinase,superoxide dismutase were subsequently measured．The rest cells were collected．The apoptosis of these cells was observed based on the Keki cell apoptosis detection kit instruction by flow cytometry,while the activity of these cardiac muscle cells was measured with the method of MTT．Results The whole experiment indicates that Rhodiola rosea Oral Liquid significantly increased the cell viability and reduced the cell death of rat primary cultured myocardial cells compared with positive control group(P＜0．01)．The assay performed indicated that the oral liquid of Rhodiola rosea lowered the myocardial enzymes level,which were induced by myocardial cell hypoxia and the levels of free radicals,showing that there was a better protective effect on hypoxic myocardial cells compared with positive control group(P＜0．01)．Conclusion Rhodiola rosea Oral Liquid can obviously improve the hypoxia tolerance of rat myocardial cells,and provide experimental data for the clinical treatment of hypoxic cardiomyopathy．

Rhodiola rosea Oral Liquid;rat;myocardial cells;hypoxia;tolerance

R285．5；R286

A

1006－4931(2016)09－0038－03

2015－10－14)