春季野菜中维生素C和氨基酸含量的测定

赵志强 徐英岚 方 杰 郑晓冬北京农业职业学院 北京 102442



春季野菜中维生素C和氨基酸含量的测定

赵志强 徐英岚 方 杰 郑晓冬
北京农业职业学院 北京 102442

摘 要：对春季在田野中生长的野菜的维生素C及氨基酸含量进行测定。方法：2、4－二硝基苯肼比色法；高效液相色谱法。结果：维生素C的测定方法操作简单、准确、精密度高，适用于蔬菜、水果中维生素C含量的测定；氨基酸含量的测定方法样品处理简单、准确、精密度高，适用于蔬菜、饲料中游离氨基酸的测定。

关键词：野菜；维生素C；氨基酸；2，4－二硝基苯肼比色法；高效液相色谱法

野菜中含有丰富的蛋白质、糖、维生素、无机盐及食用纤维等营养物质，且污染较少，食用价值很高。维生素C即抗坏血酸，一种能防治坏血病的水溶性维生素，在新鲜的水果蔬菜中含量丰富，人体自身不能合成。氨基酸为蛋白质的基本组成单位，蛋白水解后的氨基酸常见的为20余种，其中8种为必需氨基酸，他们在人体内不能合成，必须由膳食供给。笔者选择苦荬菜、苦苣菜、桔梗等数种野菜，采用2，4－二硝基苯肼法测定这些野菜中维生素C的含量；采用高效液相色谱法测定野菜中氨基酸的含量。

1 2，4－二硝基苯肼法测定维生素C的含量

1.1 原理

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4－二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。

1.2 仪器

恒温箱：37±0.5℃，可见-紫外分光光度计，匀浆机，离心机：3000 r／min。

1.3 样品与试剂

维生素C纯品购自SIGMA公司，各种野菜样品均采自校园田野，所用各种试剂均为分析纯，用水均为去离子水。

1.4 实验方法与结果

1.4.1 样品溶液的制备

野菜样品经匀浆机打碎后，取10 g～30 g，用草酸溶液定容在100 ml容量瓶中。离心，取上清液，过滤，滤液中加入活性炭，氧化脱色，再过滤，弃取初滤液。滤液置于比色管中，加入2，4－二硝基苯肼溶液，于恒温箱中（37±0.5℃）恒温3小时，然后加入85%浓硫酸，于室温放置30分钟显色，待上机测定。

1.4.2 检测波长的选择

以草酸溶解维生素C纯品，在400 nm～600 nm波长范围扫描测定，结果在508 nm处有最大吸收，选定508 nm为检测波长，如图1所示。

图1 维生素C纯品的吸收光谱

1.4.3 线性关系

精密称取抗坏血酸纯品,加草酸溶解得20 μg/ml纯品溶液。称取纯品溶液5，10，20，30，40，50，60 ml，分别置于100 ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，6，8，10，12 μg/ml。在505 nm波长处测定吸光度。以纯品浓度(μg/ml)为自变量，求得回归方程：

y=0.021x+0.0053 r = 0.9998

在1 μg/ml～12 μg/ml线性关系良好。

1.4.4 精密度实验

取各种野菜样品，按4.1步骤操作，每种样品取三组，平行测定，计算相对偏差，相对偏差均小于5%，符合测定要求。

1.4.5 样品含量测定

取各种野菜样品，按4.1步骤操作，测定各种野菜中维生素C的含量，结果见表1。

表1 样品测定结果(n=3)

1.5 结果讨论

(1)大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用草酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。

(2)活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。实验结果证明，用2 g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。

(3)若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。

(4)该方法操作简单、准确、精密度高，适用于蔬菜、水果中维生素C含量的测定。

2 高效液相色谱法测定野菜中氨基酸的含量

2.1 原理

野菜经超声波提取后，溶解在弱酸中，离心过滤后，加入衍生试剂衍生化用高效液相色谱仪测定，紫外检测器检测。

2.2 仪器与试剂

2.2.1 仪器

Waters 1525 高效液相色谱仪，2487紫外吸收检测器，超声波清洗机，低速离心机。

2.2.2 试剂

氨基酸标准品购自Waters公司，含有17种常见氨基酸，依次为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。

乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2.3 色谱条件色谱柱：Waters Accq·Tag氨基酸分析专用柱，

4 μm，3.9 mm×150 mm;流动相：A为磷酸缓冲液；

B为乙腈－水（60:40）；流速：1 mL·min-1;检测波长248 nm;柱温：37℃；梯度淋洗表见表2。

表2 梯度淋洗表

2.4 实验方法与结果

2.4.1 标准曲线实验

氨基酸标准品的浓度为2.5 μmol/mL,加水稀释十倍后，浓度为0.25 μmol/mL,加入衍生试剂衍生化反应后，分别进样5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，记录峰面积，以峰面积对浓度（μmol/mL）进行线性回归，得氨基酸各回归方程，各相关系数r 均在0.996～0.999之间，以天冬氨酸和精氨酸的回归方程为例：

天冬氨酸 Y=33.6X-3.73 r=0.997

精氨酸 Y=4.68X-1.30 r=0.998

2.4.2 精密度实验

分别取苦荬菜、桔梗、苦苣菜等几种野菜2 g～3 g,精密称定，置三角瓶中，再加0.1 mol/L Hcl约30 mL，于超声波清洗器中提取15分钟，离心，取上清液，定容于100 mL容量瓶中，加衍生化试剂反应后，分别取10 μL各种样品上机测定，每种样品平行测定三次，计算精密度，见表3。

表3 样品精密度实验结果

2.4.3 样品测定

按照精密度实验的方法处理样品，分别取10 μL各种样品上机测定，计算野菜中各种氨基酸的含量，结果见表4。

表4 样品中氨基酸含量测定结果

( *代表该氨基酸在此种野菜中未检出)

2.4.4 色谱图

氨基酸标准品的色谱图如图2所示，野菜样品的色谱图如图3所示。

图2 氨基酸标准品的色谱图

图3 苦苣菜的氨基酸色谱图

2.5 讨论

(1)该方法处理简单、准确、精密度高，适用于蔬菜、饲料中游离氨基酸的测定。

(2)样品中的氨基酸只有加入衍生试剂衍生化后，才能被紫外吸收检测器检测出来。该衍生试剂为Waters公司专利衍生试剂，衍生化过程操作简单，衍生后样品稳定时间长，达一周以上。

(3)由表4可知，几种野菜中氨基酸的分布和含量差别很大，费菜中含有的氨基酸最广泛，丙氨酸（Ala）在几种野菜中都被检测出，桔梗中的丙氨酸（Ala）含量和苦苣菜中的丝氨酸（Ser）含量达到了2.0 nmol以上。

参考文献

[1] 常碧影.氨基酸分析技术的一些研究与改进[J].中国农业科学,1985(1):41-45.

[2] 国家质量技术监督局.饲料中氨基酸的测定.GB/T 18246-2000.

[3] 国家质量技术监督局.蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定.GB/T 5009.86.

[4] 赵晨霞,石进朝,赵志强,刘继伟,郑志勇.北京地区几种野菜主要营养素的测定[J].食品科学,2005,26(9):442-445.

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The Determination of Vitamin C and Amino Acids Content in Spring Potherb

Zhao Zhiqiang, Xu Yinglan, Fang Jie, Zheng Xiaodong
Beijing Vocational College of Agriculture, Beijing, 102442, China

Abstract:In spring, for the potherb growing in field, we determinate the vitamin C and amino acids content. The methods are 2, 4-dinitrophenylhydrazine colorimetry and high efficiency liquid chromatography, and we obtain that the method on determinating vitamin C is easy operation, accurate and high precision, and it is applicable in determinating vitamin C in vegetables and fruits. Further, the method on determinating amino acids content is easy to handle sample, accurate, high precision, and it is applicable in determining dissociate amino acids in vegetables and fodder.

Keywords:potherb; vitamin C; amino acids; 2, 4-dinitrophenylhydrazine colorimetry; high efficiency liquid chromatography

作者简介：赵志强，本科，实验师。

收稿日期：2015-10-31