滋肾育胎方剂联合雌孕激素序贯疗法对卵巢早衰大鼠的影响

张丽梅，蔡 林

(南充市川北医学院，四川南充 637000)

滋肾育胎方剂联合雌孕激素序贯疗法对卵巢早衰大鼠的影响

张丽梅，蔡 林

(南充市川北医学院，四川南充 637000)

目的:研究滋肾育胎方剂联合雌孕激素序贯疗法对卵巢早衰大鼠的影响，进而探讨雌孕激素序贯治疗的最适用量。方法:选择84只Wistar大鼠，12只未作处理列为空白对照组，72只大鼠为模型组，采用自身免疫性卵巢早衰方法造模。模型组根据处理方法的不同分为模型对照组、纯激素治疗组、纯中药治疗组及中药联合激素(全量、半量及1/4量)治疗组，每组各12只。比较分析治疗3个疗程后各组大鼠性激素、抑制素B及卵巢子宫组织的变化。结果:中药联合全量激素治疗组效果最好，其次为中药+半量激素组，该组与纯激素治疗组疗效相当，中药联合1/4量激素组及纯中药治疗组治疗效果相对较差。结论:滋肾育胎方剂联合半量激素组效果较佳，中药结合全量或半量激素能够有效地改善卵巢早衰大鼠卵巢储备功能，考虑到激素的副作用，半量激素当然更好，可以有效地延缓卵巢衰老进度，减少雌孕激素用量以及激素引起的副作用。

卵巢早衰;滋肾育胎方;中西医结合;抑制素B;大鼠

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是一种原因尚不明确的原发性卵巢功能不全，主要表现为妇女在40岁以前卵巢功能表现出减退状态，出现月经稀发或闭经等，生化检测性激素结果为腺垂体分泌的卵泡刺激素和黄体生成素明显升高［1］，发病率在1%～3%［2］。中医证型主症为月经推后或月经量少、色淡质稀，次症为腰膝酸软、神疲乏力、头晕耳鸣、性欲减退、失眠多梦、心悸、少气懒言等。病因多认为与遗传、环境等因素有关，发病机制尚不明确。目前临床针对此类患者多采用激素替代疗法进行治疗，目的主要是为改善患者因低雌激素造成的阴道不适等各种围绝经期症状，以维持月经来潮，进而恢复生育功能。然而采用纯激素序贯治疗易增加肝肾功能负担，造成肝肾功能损害，还有促进子宫内膜过度生长、抑制卵巢功能、增加乳腺癌的发生率等副作用。采用中医药治疗可以改善患者的临床症状，稳定疗效，但单纯中药治疗又存在疗程较长、起效相对较慢、患者依从性较差等不足。

滋肾育胎方剂为我院治疗卵巢功能减退或卵巢早衰的临床经验方，20多年来取得了显著的临床疗效。本研究采用中药联合雌孕激素序贯疗法治疗卵巢早衰大鼠，为中西医结合治疗卵巢早衰提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

选择清洁级Wistar大鼠200只，体质量约200 g，阴道图片检测示动情周期规律，所有实验大鼠由川北医学院动物实验中心提供。

1.2 实验药物

滋肾育胎方剂组成:熟地黄20 g，党参15 g，山药30 g，山茱萸18 g，菟丝子20 g，川续断20 g，炒杜仲20 g，白术18 g，当归12 g，甘草6 g，黄芩炭6 g。将上述方剂通过煎汁使药物浓度保持在3.5 g/ml。戊酸雌二醇又名补佳乐1mg×21#，法国先灵公司生产)，醋酸甲羟孕酮片(2mg×100#，浙江仙琚制药股份有限公司生产)。佐剂为美国Sigma公司产品分装，分为弗氏完全佐剂(complete Freund’sadjuva nt，CFA)、弗氏不完全佐剂 (incomplete Freund’sadjuvant，IFA)。

1.3 方法

1.3.1 造模 根据参考文献［3］制备卵巢早衰大鼠模型。首先制备卵巢抗原，切取体质量大约为200 g Wistar雌性大鼠的卵巢组织进行称重，生理盐水漂洗，Tris-HCl缓冲液中将漂洗干净的卵巢组织剪碎并研磨成匀浆，超声粉碎机低温下粉碎约5 min，4000 r/min低温离心15 min，10000 r/min离心5 min，吸管吸取上清液，将卵巢组织液浓度调至200 mg/ml。随机选择100只Wistar雌性大鼠进行多点多处皮下注射卵巢抗原，注射剂量为每只大鼠70 mg(0.35 ml)，连续进行3次注射，每2周1次。第1次免疫加入相同剂量的CFA，第2、3次加入相同剂量的IFA;对照组(12只)给予相同剂量的生理盐水代替卵巢抗原。大鼠动情周期采用阴道涂片的方法进行检测，若大鼠动情周期延长或出现明显紊乱说明造模成功。

1.3.2 分组及给药 空白对照组大鼠12只。选择造模成功的72只Wistar大鼠按随机数字表法分为模型对照组、纯激素治疗组、纯中药治疗组及中药联合全量激素组，中药联合半量激素组，中药联合1/4量激素治疗组。模型对照组大鼠给予20 ml/ (kg·d)蒸馏水灌胃;纯激素治疗组给予补佳乐0.12 mg/(kg·d)，同时给予蒸馏水20 ml/(kg·d)进行灌胃，补佳乐灌胃治疗4d后给予醋酸甲羟孕酮0.96 mg/(kg·d)联合治疗，10 d后停药，停药1 d后开始下一周期治疗;纯中药治疗组给予滋肾育胎方剂20 ml/(kg·d)灌胃;中药联合不同剂量激素组给予相同剂量中药灌胃，同时给予全量、半量及1/4量醋酸甲羟孕酮，连续用药14 d，3个疗程后检测各组性激素、抑制素B蛋白水平。

1.3.3 检测方法 药物治疗3个疗程后，取处于动情间期Wistar大鼠腹主动脉血，离心分离血清冷冻储存，采用酶联免疫法检测E2、FSH、LH水平;摘除取血后的大鼠双侧卵巢进行称重，一侧卵巢做成病理切片并进行HE染色，常规光镜下观察染色后的病理切片，详细观察并记录卵巢组织的形态学变化。摘除另一侧卵巢采用免疫组化法测定抑制素B表达量，免疫组化图像采用Image-Pro Plus软件处理，根据图像的灰阶度进行双阈值分割，以得到半灰度目标图像，并根据阳性免疫染色强度及面积进行测定。每只大鼠标本测定5个视野，由计算机计算出所测阳性反应物相对含量的积分光密度值;所有大鼠子宫摘除并称重，经HE染色光镜下观察子宫组织形态学变化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠性激素水平及卵巢、子宫湿重比较

表1显示，与空白对照组比较，模型对照组FSH、LH水平明显升高，E2水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。纯激素治疗组、纯中药治疗组、中药+全量激素、中药+半量激素、中药+1/4量激素各组血清FSH、LH水平较模型对照组均降低、而E2水平均升高(P＜0.05)。与纯激素治疗组比较，中药+全量激素组血清FSH、LH明显降低，E2显著升高(P＜0.05);中药+半量激素组血清FSH、LH、E2轻度升高(P＞0.05);中药+1/4量激素组及纯中药治疗组FSH、LH明显升高(P＜0.05)，而与E2水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白对照组比较，模型对照组卵巢、子宫湿重均降低(P＜0.05)。中药+全量激素组卵巢、子宫湿重较模型对照组及纯激素治疗组均增加(P＜0.05)。中药+半量激素组及纯激素治疗组卵巢湿重较模型对照组均增加(P＜0.05)，与子宫湿重比较差异无统计学意义(P＞0.05)。中药+1/4量激素组及纯中药治疗组卵巢、子宫湿重与模型对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠性激素水平及卵巢、子宫湿重分析(±s)

表1 各组大鼠性激素水平及卵巢、子宫湿重分析(±s)

注:与空白对照组比较:★P＜0.05;与模型对照组比较:●P＜0.05;与纯激素治疗组比较:▲P＜0.05

组别 鼠数 FSH(IU/L) LH(ng/L) E2(ng/L) 卵巢(g) 子宫(g)空 白 对 照 组 12 4.089±0.223 15.395±0.821 55.768±1.941 0. 0.112±0.139 0.426±0.133 137±0.006 0.541±0.109模 型 对 照 组 12 7.489±0.341★ 27.232±1.397★ 37.301±1.425★ 0.113±0.012★ 0.371±0.062★纯 激 素 治 疗 组 12 5.200±0.225● 18.065±0.623● 43.791±1.411● 0.128±0.015● 0.412±0.111纯 中 药 治 疗 组 12 6.871±0.301●▲ 23.411±0.916●▲ 42.503±7.191● 0.116±0.012 0.428±0.107中药+全量激素组 12 4.481±0.231●▲ 16.125±0.783●▲ 53.872±1.603●▲ 0.133±0.012●▲ 0.551±0.112●▲中药+半量激素组 12 5.453±0.201● 19.303±0.837● 45.779±1.201● 0.127±0.007● 0.438±0.091中药+1/4量激素组 12 6.058±0.237●▲ 21.353±0.936●▲ 42.397±1.532●

2.2 各组大鼠卵巢INHB蛋白表达

表2显示，与空白对照组比较，模型对照组卵巢INHB蛋白表达量明显降低(P＜0.05)。纯激素治疗组、中药+全量激素治疗组、中药+半量激素组卵巢INHB蛋白表达量明显高于模型对照组(P＜0.05)。

表2 各组卵巢INHB蛋白表达比较

3 讨论

肾藏精，主生殖，乃先天之本，肾中充满精气，天癸成熟则月经来潮，能孕育子女，说明卵巢生殖周期开始;肾精衰竭、天癸耗竭出现经闭，则说明女性卵巢生殖功能处于衰竭状态，因此女性卵巢功能的状态与肾脏息息相关。脾为后天之本，气血生化之源，月经正常与否与脾肾功能有明显的相关性。

目前，临床对卵巢早衰患者维持正常月经一般采用中药联合雌孕激素序贯疗法进行治疗，这种治疗方法对患者的精神状态有重要的调节作用，还能维持患者正常的夫妻关系。通过外源性补充雌孕激素治疗卵巢早衰患者，能够通过反馈调节促性腺激素释放激素的分泌，从而达到降低血清中垂体分泌的FSH、LH水平，维持正常月经周期，延缓卵巢衰老的目的，也能够有效改善患者的更年期症状及提高生活质量。

滋肾育胎方剂全方由熟地黄、党参、山药、山茱萸、菟丝子、川续断、炒杜仲、白术、当归、甘草、黄芩炭组成，该方剂具有健脾补肾、益培元气及养血稳胎的作用。有学者研究发现，滋肾育胎方剂能够使实验兔性腺和性器官的血液供应增加并促进卵泡和黄体发育［4］。临床研究发现，使用滋肾育胎方剂后患者孕酮分泌增加，IVF-ET胚胎种植率提高［5］，均表明滋肾育胎方剂对卵巢功能有重要的调节作用。本研究探讨滋肾育胎方剂联合雌孕激素序贯疗法对卵巢早衰大鼠卵巢功能的影响，结果显示中药联合全量激素治疗组效果最好，其次为中药+半量激素组，该组与纯激素治疗组疗效相当。纯中药治疗效果欠佳可能与本次实验疗程较短有关。本研究从激素结果显示，滋肾育胎方剂联合不同剂量雌孕激素序贯疗法能有效抑制卵巢功能衰竭进程，滋肾育胎方剂在提高疗效的同时，可以有效减少激素用量，降低副作用。另外，子宫、卵巢质量在中药联合半量、中药联合1/4量激素时与空白对照组比较基本无变化，提示在使用中药的同时减少雌激素用量能够达到同样的调节效果。

INHB是性腺分泌的重要激素，是转化生长因子β中的一员，INHB主要在育龄期妇女卵巢组织中的颗粒细胞内表达［6］。INHB主要作用于腺垂体，通过反馈性作用抑制FSH、LH分泌。有学者研究认为，INHB评估卵巢储备功能较FSH等其他指标敏感性较强，是评估卵巢储备功能的重要指标［7-8］。本研究结果显示，模型组大鼠卵巢INHB蛋白表达量明显降低，中药联合不同剂量雌孕激素能在不同程度上促进卵巢INHB蛋白水平的表达，其中中药+全量激素与中药+半量激素疗效相当，说明运用滋肾育胎方剂有助于在减少激素用量的同时提高卵巢早衰大鼠的卵巢储备功能。

综上所述，根据本研究结果显示滋肾育胎方剂联合半量激素组效果较佳，中药结合全量或半量激素能够有效地改善卵巢早衰大鼠卵巢储备功能，考虑到激素的副作用，半量激素当然是更好的，这样可以有效地延缓卵巢衰老进度，减少雌孕激素用量以及激素引起的副作用。

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R285.5

A

1006-3250(2016)06-0785-03

2015-09-26

张丽梅(1976-)，女，四川眉山人，副教授，医学硕士，从事中医妇科的临床与研究。