慢性高原病患者骨髓有核红细胞Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表达变化

韩园芳，冀林华，刘芳，冯婷婷，李建平，马晓静，崔森，李占全

(1青海大学医学院，西宁 810000；2青海大学附属医院；3青海大学；4青海省人民医院)



慢性高原病患者骨髓有核红细胞Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA表达变化

韩园芳1，冀林华2，刘芳3，冯婷婷1，李建平4，马晓静2，崔森2，李占全2

(1青海大学医学院，西宁 810000；2青海大学附属医院；3青海大学；4青海省人民医院)

摘要：目的观察慢性高原病(CMS)患者骨髓有核红细胞Ras相关GTP酶(Ras-GTP)分泌水平及B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1(ERK1)、细胞信号调节激酶2(ERK2)表达变化。方法 CMS患者15例(观察组)，单纯陈旧性骨折患者15例(对照组)，采用ELISA法检测骨髓有核红细胞Ras-GTP，实时荧光定量PCR法检测骨髓有核红细胞BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA。结果与对照组比较，观察组Ras-GTP分泌水平升高，BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相对表达量增加(P均<0.05)。观察组Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA与HGB呈正相关(r分别为0.860、0.849、0.653、0.773、0.746，P均<0.01)。结论 CMS患者骨髓有核红细胞Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2表达升高，Ras/Raf/MEK/ERK通路可能与CMS红细胞的过度累积有关，推测其可能是CMS发病机制中的重要通路之一。

关键词：高原病；骨髓有核红细胞；Ras/Raf/MEK/ERK信号通路

慢性高原病(CMS)既往又称为高原红细胞增多症，以过度红细胞增多和严重低氧血症为特征[1]，并伴有血红蛋白(HGB)及红细胞压积升高，但目前其发病机制尚未完全阐明。研究[2]认为，CMS发生病理生理改变的主要机制是机体对高原环境失适应，导致细胞内低氧，引起低氧诱导因子表达增加，促进促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)等下游基因的表达，从而促进细胞的增殖。Ras/Raf/MEK/ERK信号通路通过瀑布式的激活过程将细胞外的信号传递到细胞核，通过调节细胞周期调控细胞的增殖、分化和凋亡。本研究观察了CMS患者骨髓有核红细胞Ras-GTP分泌水平及B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1(ERK1)、细胞信号调节激酶2(ERK2)表达变化，并探讨其意义。

1资料与方法

1.1临床资料选取2014年9月～2015年10月青海大学附属医院收治的CMS[1]患者15例(观察组)，均为男性，年龄(50.4±3.5)岁；均为汉族，且长期居住在海拔2 500 m以上的地区。另选15例单纯陈旧性骨折患者作为对照组，患者均为男性，年龄(48.9±2.3)岁。两组一般资料比较无统计学差异，具有可比性。所有受试对象均签署知情同意书，并经青海大学附属医院医学伦理委员会同意。

1.2骨髓有核红细胞采集、分选及培养采集受试对象骨髓液10 mL，用Ficoll淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，以CD71、CD235a抗体磁珠分选阳性细胞，将分选的CD71、CD235a阳性细胞以1×106/mL培养于5 mL IMDM培养体系中(含30%胎牛血清、20 ng/μL IL-3、10 μmol/mL EPO、69%IMDM)，37 ℃、5%CO2、3%O2的培养箱内低氧培养72 h。

1.3骨髓有核红细胞分泌的Ras-GTP检测将培养后的骨髓有核红细胞以800 r/min离心，收集离心后的上清液，采用ELISA法检测Ras-GTP，操作严格按ELISA试剂盒说明进行。

1.4骨髓有核红细胞BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA检测收集培养后的有核红细胞，按TRIzol 试剂盒说明裂解细胞，提取总RNA。采用逆转录试剂盒合成cDNA，用于PCR扩增，50 ℃、2 min，95 ℃、15 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40个循环。PCR产物于Roche LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR系统扫描，读取CT值。目的基因的相对表达量以2-ΔΔCT表示。

1.5外周血HGB、血氧饱和度、红细胞压积检测抽取受试者外周血，采用XE-2100全自动细胞分析仪检测HGB、红细胞压积，指套式光电传感器检测血氧饱和度。

2结果

两组Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相对表达量比较见表1。两组外周血HGB、血氧饱和度、红细胞压积比较见表2。观察组中Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA与HGB呈正相关(r分别为0.860、0.849、0.653、0.773、0.746，P均<0.01)。

表1　两组Ras-GTP分泌水平及BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

表2　两组HGB、血氧饱和度、红细胞压积比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

3讨论

CMS是以过度红细胞增多和严重低氧血症为特征[1]，并伴有HGB及红细胞压积升高。研究[3]发现，CMS骨髓红细胞增生明显活跃，以晚幼红细胞增生明显，且骨髓组织血管增生显著。

近年来，Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路与低氧相关性疾病的关系越来越受到重视。发生CMS时，低氧诱导因子高表达，可广泛激活众多低氧反应基因如EPO、VEGF等，EPO可与促红细胞生成素受体(EPOR)相互作用而激活JAK2基因[4]，使EPOR磷酸化，EPOR胞质SH2结构域与Grb2结合，吸引具有鸟苷酸交换因子活性的SOS至细胞膜，促进Ras-GDP转换为Ras-GTP，导致Ras活化，依次激活MEK、ERK，进入核内促进多种转录因子磷酸化，从而调控细胞增殖、分化、凋亡、转移等功能[5～7]。研究[8]发现，CMS患者VEGF水平升高，VEGF在CMS中的作用主要是诱导血管形成，增强血管的通透性。而VEGF不仅仅是血管生成因子，而且与造血调节有密切关系。VEGF作为肝表面细胞膜生长因子，受到刺激过度表达时，会激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，此通路持续活化后，通过抑制细胞凋亡、促进细胞存活及促进耐药基因的表达，最终导致肝细胞异常增殖及肿瘤形成[9]。Ras/Raf/MEK/ERK通路不仅与肝细胞癌有关，在多种实体肿瘤及其他疾病中均检测到该通路的异常激活，如食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、口腔癌、自闭症等[10～14]。

本研究显示，观察组Ras-GTP分泌水平较对照组升高，BRaf、MEK、ERK1、ERK2 mRNA的相对表达量较对照组增加；观察组Ras-GTP、Braf mRNA、MEK mRNA、ERK1 mRNA、ERK2 mRNA与HGB呈正相关。提示Ras/Raf/MEK/ERK通路可能与CMS红细胞的过度累积有一定关系，推测其可能是CMS发病机制中的重要通路之一。

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(收稿日期:2015-11-05)

中图分类号：R555.1

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2016)03-0052-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.019

通信作者：冀林华(E-mail: lindaji1@163.com)

基金项目：青海省科技厅国际合作项目(2014-HZ-808)；国家自然科学基金资助项目(81441116)；青海省科技厅(应用)基础研究计划项目(2012-Z-729)。