细胞膜色谱法在防治心脑血管疾病研究中的应用

宋丹宁，隋殿军* ，李 娜，李 辉

(1.长春中医药大学， 长春 130117；2.吉林省前卫医院，长春 130000)



细胞膜色谱法在防治心脑血管疾病研究中的应用

宋丹宁1，隋殿军1*，李 娜1，李 辉2

(1.长春中医药大学， 长春 130117；2.吉林省前卫医院，长春 130000)

随着社会压力和老龄化的发展，心脑血管疾病成为严重影响人们健康的重要疾病，高通量筛选和开发防治心脑血管疾病的药物成为中药研究的热点。生物色谱膜因其具有高稳定性、高重复性、灵敏快捷等特点逐渐在防治心脑血管疾病药物开发中受到重视。细胞膜色谱法的运用加快了中药有效成分分离纯化的进展，有望实现其高通量的筛选，对心脑血管疾病的防治具有深远的影响。

生物色谱技术；心脑血管疾病；细胞膜色谱法

随着科学技术的迅速发展，各种新兴技术和交叉技术的不断出现，生物色谱法随之产生，并广泛应用于中药的质量监控、活性成分的筛选、药物与受体及受体亚型亲和作用，对于中药在药理学中的应用与研究均具有促进作用。大多数中药都含有大量的化学成分,由于产地、环境、炮制和贮存方式的不同[1]，其对应的活性也有显著不同，因此运用生物色谱进行谱效学的研究具有重要意义。

1 细胞膜色谱法概况

生物色谱技术是采用各种具有生物活性的材料作为固定相，进行分离和制备具有生物活性的药物组分的一种技术，一般选用活性细胞膜、植物细胞、活性细胞、生物大分子作为固定相。根据不同的固定相可将生物色谱法分为细胞膜色谱法、细胞生物色谱法、分子生物色谱法等[2]。

其中细胞膜色谱法(CMC)是将动物或植物活性细胞膜结合到活化的硅胶表面，制成细胞膜固定相(CMSP)，药物作为流动相在色谱中进行流动，根据不同的活性成分和作用程度的差别表现出不同的保留特性，由此进行中药活性成分的分离纯化与筛选和每种成分作用的靶点与受体的研究[3]。中药在进入CMSP后，色谱柱将具有活性的化学成分或化学有效结构进行保留，并且将这些成分进行分析鉴定，无活性的组分则随之流出，可得到单味中药未知的活性单体或化合物。CMC将高效液相色谱、细胞生物学以及药理学相结合，根据受体学说，利用中药与膜受体之间存在的特异性亲和力，通过色谱参数，探究药物与细胞膜受体之间的相互作用，更进一步研究药物在细胞上作用的机制，对中药药理学研究具有重要意义。CMC还存在另一种细胞膜色谱模型，是直接选取效应器官的细胞膜和中药提取液共同在适宜的培养基中进行孵育，一段时间后利用活性细胞膜去固相化中药的成分，使效应成分与细胞膜进行特异性结合，再进行分离和鉴定。

2 细胞膜色谱法应用

将CMC与高效液相色谱联用，筛选出红毛七中的活性成分红毛新碱(caulophine)，能够与塔斯品碱共同作用于表皮生长因子受体。将HEK293细胞膜作为固定相，筛选出红毛七中能与α1受体结合的活性物质为红毛新碱，作为α1受体抑制剂。运用CMC，并结合LC-MS联用色谱法检测在前列腺细胞膜固定相模型上，筛选钩藤中与α1A肾上腺受体(α1A-AR)结合的活性成分，检测出钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱4种单体均能与α1A-AR结合并且产生活性[4]。

将高表达EGFR的HEK293细胞膜与硅胶载体进行结合作为固定相，通过与质谱(MS)联用，检测马钱子中抗EGFR的活性成分为马钱子碱和番木鳖碱，能够减轻胞外信号调节激酶(Erk)的磷酸化，组织下游相关信号分子的表达，抑制HEK293细胞的增殖[5]。选用硅胶作为载体制备前列腺细胞膜固定相，结合LC/MS进行测分析，得到莲子心中莲心碱、异莲心碱、荷花碱几种α1受体抑制剂活性成分[6]。通过CMC与LC/MS技术的相结合，初步筛选和鉴定出中药佛手中能作用于血管平滑肌细胞膜上受体的有效成分为佛手柑内酯[7]。

选取大鼠心肌细胞作为固定相，利用CMC并结合高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)筛选出乌头中8种具有生物活性的化学成分[8]。进一步通过CMC对乌头进行筛选，筛选出作用于心肌细胞膜的4种活性成分，分别为塔拉乌头胺(TALA)、14-乙酰基-塔拉乌头胺(14-acetyl-TALA)、异叶乌头素(hetisine)、14-benzoylneoline，这四种成分能够阻碍阿霉素诱导的心衰[9]，减轻心脏的损害。

通过建立SH-SY5Y细胞膜固相色谱模型，将远志皂苷碱水解产物作用于H2O2处理后SH-SY5Y细胞膜，筛选出与细胞膜相互作用且具有抗早老性痴呆的活性成分，再经过HPLC对活性成分进行分析鉴定，分别为细叶远志皂苷、黄花倒水莲皂苷A、3,4,5-三甲基肉桂酸和对甲氧基肉桂酸。

对于药物与受体相互作用的方法有放射性培基结合法(RBA)、功能实验分析法(FTA)、荧光内反射法(TIRF)、亲和色谱法(AC)以及液闪接近测定技术(SPA)等，而这些方法虽然灵敏度高且准确，但操作复杂且费时，会造成同位素对环境的污染，对于非放射性标记药物不能直接获得与受体作用的信息，相比之下CMC的研究方法简便、灵敏度高、效率高。

对荷兰猪的空肠细胞膜进行CMC和RBA两种方法的建立，通过两种方法对8种毒蕈碱受体配体与毒蕈碱受体的亲和作用进行对比和比较，结果显示，CMC得到的色谱参数与RBA检测的亲和力具有相同的顺序[10]。检测4种川芎化学成分在心肌细胞膜固定相的色谱柱上的保留特性，探讨这4种化学成分与心肌细胞膜受体的亲和性和相互作用[11]。将体外培养的ECV304细胞作用在硅胶的载体上，制备成ECV304细胞膜固定相，利用血管内皮细胞膜色谱模型筛选出红毛七中的活性成分，并且进一步研究发现，其中含有的塔斯品碱在色谱条件下能选择性地作用于血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)，且抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的血管内皮细胞官腔的形成[12]。将9种药物作用于血管内皮细胞膜色谱模型，检测这9种不同的配体与受体的亲和顺序，结果表明血管内皮细胞膜色谱模型稳定性较高。

通过A431细胞膜色谱模型筛选出苦参中苦参碱和氧化苦参碱能够作用于表皮生长因子受体(EGFR)，且亲和程度与作用方式与吉非替尼相似[13]。将建立的HepG2细胞膜色谱模型联用质谱分析，分选出黄柏中黄连素和延胡索乙素，以及苦参中的苦参碱和氧化苦参碱4种活性成分，能与HepG2细胞膜的EGFR相结合[14]。建立大鼠纹状体细胞膜色谱模型，将川芎-白芷药对注入色谱柱中，检测出川芎-白芷药对可能与5-羟色胺(5-HT)受体结合，从而激活5-HT受体，收缩颅外血管，减轻发作时颅外血管的扩张，治疗偏头痛[15]。

3 结语

CMC通过与高效液相色谱、液相色谱-质谱联用等技术的结合，广泛应用于中药的分离纯化和活性筛选，而且具有高稳定性、高重复性、灵敏快捷等特点。CMC也可对药物与细胞膜结合后相关的参数，分析药物活性成分与膜受体蛋白结合的亲和力，其结合更为特异性、适用性、多靶点性等特点。CMC的运用加快了中药有效成分的分离纯化的进展，有望实现其高通量的筛选，促进了现代中药药理的研究和发展，对心脑血管疾病的防治具有深远的影响。

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Cell Membrane chromatography in application of prevention and treatment of disease of heart head blood-vessel

SONG Danning1,SUI Dianjun1*,LI Na1,LI Hui2

(1.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.Avant-garde Hospital of Jilin Province,Changchun 130000,China)

With the development of social pressure and aging,disease of heart head blood-vessel has become an important disease,serious impact on people's health and development of high-throughput screening of prevention and cure of disease of heart head blood-vessel drugs become hot topics in the study of traditional Chinese medicine (TCM).Biological membrane chromatography because of its characteristics such as high stability,high repeatability,sensitive and quick gradually in the prevention and treatment of disease of heart head blood-vessel drug development.Cell membrane chromatography used to speed up the progress in the isolation and purification of effective components of traditional Chinese medicine,is expected to achieve its high throughput screening,have a profound effect on the prevention and treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases.

biological chromatography technology;disease of heart,head and blood-vessel;cell membrane chromatography

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.057

吉林省科技发展计划项目(20130522046JH)；吉林省卫生厅青年科研(2013Q001)；吉卫科技教函(201444)。

宋丹宁(1981-)，男，助教，博士研究生，主要从事中医内科心脑血管疾病研究。

R329.2

A

2095-6258(2016)06-1262-03

2015-11-26)

*通信作者：隋殿军，男，教授，电子信箱-804910835@qq.com