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碳离子束辐照选育截短侧耳素菌原生质体

2016-03-22都雯玥陆锡宏李雪虎周翔梁剑平辛志君

辐射研究与辐射工艺学报 2016年1期
关键词:侧耳吸收剂量原生质

都雯玥陆锡宏李雪虎周 翔梁剑平辛志君

1(中国科学院近代物理研究所 兰州 730000)2(兰州理工大学生命科学与工程学院 兰州 730000)



碳离子束辐照选育截短侧耳素菌原生质体

都雯玥1,2陆锡宏1李雪虎1周 翔1梁剑平1,2辛志君1

1(中国科学院近代物理研究所 兰州 730000)
2(兰州理工大学生命科学与工程学院 兰州 730000)

摘要使用12C6+离子束辐照Clitopilus pinsitus 原生质体至不同吸收剂量,运用琼脂柱预筛和96孔板固体发酵选育截短侧耳素高产变异株。结果显示,最佳12C6+离子束吸收剂量为1.5 Gy,在该吸收剂量下正变异率为37.58%。选育出C.pin15I5E和C.pin15II6B两株正变异株,其产量较出发菌株分别提高16.17%和15.47%。表明重离子束辐照原生质体是行之有效的工业微生物诱变育种方法。

关键词碳离子束,辐照,Clitopilus pinsitus原生质体,高产变异株,截短侧耳素

Supported by National High Technology Research and Development Program of China (863Program) (2011AA10A214) and Gansu Local Pharmaceutical Industry Development Fund (Y361010SJ0)

Frist author: DU Wenyue, female, was born in June 1988 and graduated from Gansu Agricultural University in 2011. Now she is a master candidate of Lanzhou University of Technology, majoring in microbial mutation breeding

Received 10 September 2015, accepted 10 November 2015

Breeding pleuromutilin protoplasts strains by carbon ion beam irradiation

DU Wenyue1,2LU Xihong1LI Xuehu1ZHOU Xiang1LIANG Jianping1,2XIN Zhijun1

1(Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)
2(Life Science and Engineering College, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACT Clitopilus pinsitus protoplast was irradiated by12C6+ion beam at varied absorbed doses for mutagenesis, and high-yielding pleuromutilin mutant strains were screened using high-throughput method and solid fermentation. The results showed that the optimum12C6+ion beam absorbed dose is 1.5 Gy, and under this condition the positive mutation rate is 37.58%. By agar column prescreening and 96-plate solid fermentation, the mutant strains, C.pin15I5E and C.pin15II6B, were selected. The yields of the strain increased by 16.17% and 15.47%, respectively, compared with that of the original strain. The research suggests that applying heavy ion irradiation to protoplast is a possible method to breed mutant strains.

KEYWORDS Carbon ion beam, Irradiation, Clitopilus pinsitus protoplast, High-yielding mutant strain, Pleuromutilin

CLC Q691.5, TL99

截短侧耳素是斜盖菇属(Clitopilus)真菌产生的一种二萜抗生素,对支原体和一些革兰氏阳性菌有较强抗菌活性,其衍生物如泰妙菌素具有生物利用率高、毒性低和残留少的优势,作为饲料添加剂应用于家畜家禽养殖[1-3]。目前,国内截短侧耳素生产企业少,发酵技术不成熟,菌株截短侧耳素产量低,发酵周期长[2,4],通过诱变选育截短侧耳素高产菌株具有可观的经济效益。

重离子束辐照是一种新型的诱变手段,具有突变频率高、突变谱广、能够打破基因连锁、促进基因重组等优点[5-7]。离子注入细胞,可以引起DNA损伤,激发细胞修复机制,最终形成碱基缺失和颠换,DNA片段缺失和插入等突变[8-10]。陈宇等[11]使用N+离子束辐照红霉素产生菌,经过筛选得到高产突变菌,其摇瓶发酵证明产量较原始菌株提高20%以上。颉红梅等[12]使用O6+离子束辐照庆大霉素产生菌,通过选育得到产量提高30%的高产菌。重离子束辐照微生物菌株为医药行业提供高产菌株,显示出较大的先进性,探索重离子对微生物突变剂量阈值具有重要的理论价值和应用价值[5]。

原生质体诱变技术采用对数生长期的细胞制备代谢旺盛、对诱变剂敏感、变异幅度大的原生质体,再辅以常规的物理、化学诱变方法,从而选育理想的突变株[13]。李霞光[14]用氮离子注入诱变L-异亮氨酸产生菌及其原生质体,进行理化诱变,对比发现原生质体的总突变率和正突变率高于菌丝体,而且原生质体存活率也高于菌丝体。丁晓兵[15]使用N+注入的钝齿棒杆菌原生质体,选育获得遗传稳定性较好的L-异亮氨酸高产菌,其产率比原始菌株提高43.66%。本实验使用12C6+离子束辐照Clitopilus pinsitus原生质体,结合截短侧耳素对金色葡萄球菌有较高抗菌作用的特点建立高通量筛选方法[1,3],期望选育出截短侧耳素高产菌株,并为原生质体重离子诱变提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

Clitopilus pinsitus由山东东药药业股份有限公司提供。金色葡萄球菌Staphyloccocus aureus保存于中国科学院近代物理研究所重离子辐照药物研发中心。

1.1.2培养基及试剂

LB培养基(质量分数):蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、磷酸氢二钾0.5%、氯化钠1%、琼脂1.8%~2.0%、pH=7.0。斜面培养基(质量分数):麦芽提取物1.9%、葡萄糖0.4%、酵母浸粉0.4%、棉籽粉0.3%、琼脂2.0%、pH自然。液体培养基(质量分数):麦芽提取物1.9%、葡萄糖0.4%、酵母浸粉0.4%、棉籽粉0.3%、硝酸钙0.05%、碳酸钙0.05%、pH=6.2。再生培养基(质量分数)麦芽提取物1.9%、葡萄糖0.4%、酵母浸粉0.4%、棉籽粉0.3%、琼脂0.8%、pH值自然,使用0.4 mol/L甘露醇稳渗剂代替纯水配制。

0.4mol/L甘露醇(Spectrum)稳渗剂:称取109 g甘露醇溶解于1 L去离子水中,高压灭菌备用。2.5%破壁酶解液:精确称取蜗牛酶(北京索宝生物科技有限公司)、纤维素酶,溶解于0.4 mol/L甘露醇稳渗剂中,使用0.22 μm滤膜过滤除菌备用。

磷酸二氢钾(分析纯)、乙腈(色谱纯)、去离子水、截短侧耳素标准品。

1.1.3实验仪器

高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、BSP-250生化培养箱(上海博讯公司)、HF Super NW超纯水系统(上海康雷分析仪器有限公司)、HFsafe1200生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)、电子天平(Sartorius)、96孔细胞培养板(Coaster)、35 mm辐照培养皿(Corning)、Waters2695E高效液相色谱仪。

1.2方法

1.2.1Clitopilus pinsitus原生质体制备

根据文献报道[16],经过试验优化,确定原生质体的制备条件为:液体静置培养5 d的菌丝体,以0.4 mol/L甘露醇为稳渗剂,2.5%蜗牛酶+2.5%纤维素酶混合酶,25℃酶解1.5 h,纯化酶解液,获得原生质体悬浮液。对照组吸取1 mL原生质体悬浮液,稀释10倍,吸取1 mL稀释液涂布于再生培养基上,计算原生质体再生个数。

1.2.212C6+离子束辐照诱变

吸取1 mL原生质体悬浮液加入无菌35 mm辐照培养皿中,放在中科院近代物理所自制的旋转轮盘上,利用兰州重离子加速器国家重点实验室提供的重离子束12C6+,设定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 Gy 6个吸收剂量,剂量率为1.0 Gy/min,每组3个平行。重离子束12C6+的辐射参数为:初始能量80 MeV/u 的12C6+穿透50 μm不锈钢窗、 1.3 m的空气和1 mm的PE辐照培养皿后能量为76.37 MeV/u,预计稳渗剂中射程16 mm,峰位15.5 mm。辐照后,将处理组Clitopilus pinsitus原生质体悬浮液稀释10倍,将稀释液涂布于再生培养基上,培养7~14 d,按公式(1)计算致死率。

式中:rF(Fatality rate)为辐照致死率;Ni(Number of regenerated strains from irradiation group)为处理组再生菌株个数;Nc(Number of regenerated strains from control group)为对照组再生菌株个数。

1.2.3Clitopilus pinsitus变异菌株琼脂柱预筛选

参考文献[17]和文献[18]中琼脂柱筛选法,用高压灭菌的牙签挑取培养了7~14 d、约1 mm2大小诱变再生菌株,接入96孔板中,进行编号,培养5 d后使用牙签对号接种到新的96孔板中,再培养7 d后用牙签连同琼脂柱一起挑出,均匀放在涂布了500 μL、浓度106~8菌落/mL金色葡萄球菌的90 mm一次性培养皿上,28℃培养48 h。选取抑菌圈大于空白组的菌株,进行96孔板固体发酵培养。正变异率是某吸收剂量下诱变菌株中抑菌圈直径大于空白组的菌株个数占总菌株个数的百分比。

1.2.4固体发酵培养筛选

预筛选出的菌株使用96孔板发酵培养11 d,甲醇超声提取发酵产物,使用高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)法检测菌株的截短侧耳素发酵产量,检测条件为:Agilent Zorbax C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm),流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液与乙腈混合液(二者体积比为55:45),流速1.0 mL/min,柱温25℃,检测波长205 nm,进样量20 μL[19]。

2 结果与分析

2.1辐照致死率和正突变率

使用12C6+离子束辐照Clitopilus pinsitus 原生质体至不同吸收剂量,统计辐照致死率,结果见图1。由图1可知:吸收剂量在0.5 Gy和3 Gy时致死率分别为92.56%和93.46%;吸收剂量为1 Gy时,致死率最低为90.92%;总体辐照致死率高于90%。根据图2所示,当吸收剂量为1.5 Gy时,筛选得到较多的正变异菌株,其正变异率为37.58%。结果表明,Clitopilus pinsitus原生质体12C6+离子束辐照最佳吸收剂量为1.5 Gy。同时,实验得到典型“马鞍型”曲线,并且在“马鞍型”区域内出现较高的正变异率,符合重离子辐照微生物的生物学效应规律,即当吸收剂量为1~1.5 Gy时,Clitopilus pinsitus原生质体激发DNA修复,细胞存活率、变异率提高[6]。

2.2截短侧耳素高产变异菌株筛选

使用SPSSv21统计分析软件对出发菌株C.pin0的抑菌圈直径大小进行单样本t检验,最终确定选取诱变菌株中抑菌圈直径大于25 mm的菌株为正变异菌株。本次实验共计预筛选得到104株高产变异菌株,表1为部分抑菌圈直径大于等于28 mm的高产变异菌株,较出发菌株截短侧耳素产量提高22.8%以上。其中选取个别产量提高27.2%以上的菌株进行96孔板固体发酵培养11 d,甲醇提取发酵产物,使用HPLC进行检测。

表1 截短侧耳素高产变异菌株琼脂柱预筛选结果Table 1 Screening results of high pleuromutilin producing mutant strains by agar plug method

通过琼脂柱预筛实验,选出5株抑菌圈直径超过29 mm的菌株,在25℃、40%~50%湿度条件下固体发酵培养11 d,HPLC检测诱变菌株截短侧耳素的含量,筛选出两株高产变异菌株,产量分别为330.4和328.4 μg/mL,较出发菌株提高16.17%和15.47%(见表2)。

表2 变异菌株截短侧耳素产量Table 2 Pleuromutilin production of the mutant strains

3 讨论

Clitopilus pinsitus是高等丝状真菌,实验室培养条件下不产孢子[20-21],为获得单核细胞,笔者进行了Clitopilus pinsitus原生质体制备并采用原生质体诱变技术育种。12C6+离子束辐照Clitopilus pinsitus原生质体在1.5 Gy吸收剂量下选育出两株截短侧耳素高产变异菌株,其截短侧耳素产量较出发菌株分别提高16.17%和15.47%。重离子束辐照原生质体后,其再生菌株呈现“马鞍形”存活曲线,即随着吸收剂量的增加,致死率先出现降低趋势,1 Gy时致死率最低,随后致死率又升高,体现了重离子束辐照后细胞的HRS/IRR效应,即低剂量辐照超敏感效应及增强的辐射抗性[6]。实验结果还表明1.5 Gy是产生最高的正变异率的最佳吸收剂量。“诱导修复”模型对这一效应的解释为[6]:1~1.5 Gy阈值的12C6+离子束辐照激发Clitopilus pinsitus原生质体对损伤DNA的修复,结果提高了细胞的存活率,并出现较高的正变异率。

目前,原生质体诱变技术最常用的物理诱变剂有紫外线、激光、γ-射线等[13]。紫外线促使DNA分子形成嘧啶二聚体,产生基因突变,这种单一的损伤难以产生较高的突变率[22]。如薛正莲等[23]使用紫外-激光复合诱变Streptmyces lincolsis原生质体选育林可霉素高产菌株,正突变率最高为20%。激光辐照产生光、热、压力和电磁场效应,主要引起细胞酶活性和细胞代谢活动的改变,对DNA突变和染色体畸变的影响较低[22]。如陈五岭等[24]使用He-Ne激光诱变原生质体选育四环素高产菌,四环素平均产量较原始菌株提高9.32%。与传统的理化诱变方法相比,重离子束传能线密度大,与微生物细胞相互作用过程中发生质量沉积,形成的Bragg峰使样品局部受损,通过调节离子能量改变局部受损位置能实现定点、定位诱变,相对生物学效应高,产生大量稳定突变体[5-7]。而且,Clitopilus pinsitus是多核体,截短侧耳素合成受基因簇主导[25-27],遗传背景复杂,目的基因难找,重离子束辐照是最直接可靠的诱变手段。调节质量数、电荷数和能量等重离子参数,并且采用不同方法处理微生物,可以筛选符合不同需求的突变体。针对不产孢子的担子菌类,重离子辐照技术与原生质体诱变技术结合进行微生物育种具有一定的应用价值。

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Corresponding author:Ph.D. LI Xuehu, associate professor, E-mail: lixh@impcas.ac.cn

收稿日期:初稿2015-09-10;修回2015-11-10

通讯作者:李雪虎,博士,副研究员,E-mail: lixh@impcas.ac.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010402

中图分类号Q691.5,TL99

基金资助:国家高技术研究发展计划(863计划)(2011AA10A214)和甘肃省陇药产业发展专项(Y361010SJ0)项目资助

第一作者:都雯玥,女,1988年6月出生,2011年毕业于甘肃农业大学,现为兰州理工大学在读硕士研究生,方向为微生物诱变育种

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