TGF-β1抑制剂增加H460肺癌细胞的放射敏感性

黄浅漪 赵一凡 蒋友芹 王敬东 杨红英（苏州大学医学部放射医学与防护学院/放射医学及交叉学科研究院 苏州 215123）



TGF-β1抑制剂增加H460肺癌细胞的放射敏感性

黄浅漪 赵一凡 蒋友芹 王敬东 杨红英
（苏州大学医学部放射医学与防护学院/放射医学及交叉学科研究院 苏州 215123）

摘要探索一种TGF-β1受体激酶的选择性抑制剂SB431542对H460非小细胞肺癌细胞的放射增敏作用及对其DNA损伤应答体系的干扰。采用克隆形成实验检测SB431542对H460细胞放射敏感性的影响；用移植瘤实验验证SB431542在体内对H460细胞的放射增敏作用；采用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡；用免疫荧光检测53BP1 foci和磷酸化的DNA-PKcs foci。结果发现，SB431542可增加H460的放射敏感性。照射前用SB431542预处理H460细胞虽然快速启动了细胞的DNA损伤应答反应，但却抑制了DNA双链断裂的非同源末端链接修复，因此，导致细胞残留更多未修复的DNA双链断裂，从而产生更严重的细胞周期阻滞。研究还发现，这种增敏作用与细胞凋亡无关。体内移植瘤实验表明，与单独照射组相比，连续3次用SB431542联合5 Gy的X-射线处理明显在处理后第5～12 d之间降低了肿瘤的生长。这些结果显示，在照射前用SB431542抑制肿瘤细胞的TGF-β1通路，能降低其DNA损伤修复能力，改变细胞周期分布，降低细胞克隆形成能力，延缓肿瘤的生长，因此用SB431542抑制TGF-β1通路可作为一些类型肺癌病人放疗的有效辅助手段。

关键词H460细胞，TGF-β1，抑制剂SB431542，放射敏感性，DNA损伤应答

校优势学科建设工程资助项目(PAPD)和苏州大学大学生莙政学者基金（黄浅漪）资助

第一作者：黄浅漪，女，1992年出生，目前是苏州大学第二附属医院放射治疗科在读研究生，从事放射医学研究；E-mail: qianyi.huang@qq.com

Supported by National Natural Science Foundation of China (No. 31270898 and 11335011), the Key Program of Natural Science

Foundation of Jiangsu Educational Committee (12KJA310005), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher

Education Institution (PARD), and Junzheng Scholarship of Soochow University (to HUANG Qianyi)

First author: HUANG Qianyi, female, was born in 1992. Now she is a master candidate of Department of Radiotherapy and Oncology, Second Affiliated Hospital, Soochow University, engaging in the field of radiation medicine. E-mail: qianyi.huang@qq.com

Received 22 October 2015; accepted 30 December 2015

TGF-β1 inhibitors increasing the radiosensitivity of H460 lung cancer cells

HUANG Qianyi ZHAO Yifan JIANG Youqin WANG Jingdong YANG Hongying
(School of Radiation Medicine and Protection, Medical College/School for Radiological and Interdisciplinary Sciences (RAD-X), Soochow University, Suzhou 215123, China)

ABSTRACT The purpose of this study was to investigate the radiosensitizing effect of SB431542, a selective inhibitor of TGF-β1 receptor, on H460 non-small-cell lung cancer cells and relative interfering effect on DNA damage response (DDR). Clonogenic assay was used to measure the radiosensitizing effects of SB431542 on H460 cells; xenograft mouse model was used to study the radiosensitization in vivo; flow cytometry was used to determine cell cycle distribution and apoptosis; immunofluorescence microscopy was used to assess 53BP1 foci and pospho-DNA-PKcs foci. The results showed that SB431542 could increase the radiosensitivity of H460 cells.Pretreatment of H460 cells with SB431542 prior to irradiation initiated fast DDR but inhibited DNA repair via non-homologous end joining pathway and thus resulting in more unrepaired DNA double strand breaks, which caused more severe cell cycle delay. However, apoptosis did not contribute to the radiosensitization. The data from xenograft model showed that compared with irradiation alone, the combination of SB431542 and 5 Gy of X-rays on three consecutive days significantly delayed the tumor growth from 5～12 d post treatment. All the above indicate that inhibition of TGF-β1 pathway using SB431542 prior to irradiation can attenuate DNA damage repair and disturb cell cycle distribution, leading to decreased clonogenic cell survival and tumor growth delay, which can be an effective adjunct in radiotherapy for certain lung cancer subtypes.

KEYWORDS H460 cells, TGF-β1, Inhibitor SB431542, Radiosensitivity, DNA damage response

CLC Q691, TL71

我国肺癌发病率逐年上升，已成为对人民健康威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。肺癌的主要类型为非小细胞肺癌。对早期非小细胞肺癌的治疗方式主要是手术加术后化疗或放疗；但对于大约25％不能进行手术的非小细胞肺癌病人来说，立体定位放射治疗被认为是目前最合适的治疗选择[2]。但由于肺癌细胞的低放射敏感性可能导致放疗的成功率无法得到保障[3]，因此对于增加肺癌细胞辐射敏感性的研究迫在眉睫。

转化生长因子-β1(TGF-β1)是一个在调节细胞和组织的动态平衡包括增殖、分化、迁移、细胞存活和血管生成等信号通路中起着重要作用的细胞因子[4]。研究发现，TGF-β1在肿瘤形成后期起着促进肿瘤生长的作用[5-7]，可能作为肿瘤治疗中的一个有效标靶[8]。另外，研究还发现TGF-β1对细胞的DNA损伤应答反应也有着重要调控作用[9]，如抑制TGF-β1通路可以抑制上皮细胞对DNA损伤的应答，其中包括抑制ATM和ATR的活性、减弱Chk2、Rad17和p53的磷酸化从而增加细胞的放射敏感性，这提示抑制TGF-β1通路有可能提高肿瘤放射治疗的成功率[9]。实际上，有研究已证实细胞受照前用TGF-β1通路抑制剂LY364947处理，即可通过减缓DNA损伤修复和降低克隆形成率从而增加乳腺癌细胞[10]和非小细胞肺癌细胞[11]的放射敏感性。另一种TGF-β1通路抑制剂LY2109761与电离辐射协同作用在体内也延缓了肿瘤的生长[10]。另外，体内体外实验还显示LY2109761可增加胶质母细胞瘤的放射敏感性[12]。

TGF-β1已被证实与癌症患者放疗后的肺损伤和纤维化有关，抑制TGF-β1可作为用于预防或减轻放疗引起的正常肺组织损伤的分子疗法[13]。因此如果抑制TGF-β1能在减轻肺纤维化的同时增加肺癌细胞的放射敏感性，那么TGF-β1抑制剂将成为肺癌放疗的一种有效的辅助方法。已有研究显示TGF-β1通路抑制剂LY364947可以增加A549和H1299肺癌细胞的放射敏感性[11]。因此，本研究以H460非小细胞肺癌细胞为研究对象，研究另一种TGF-β1抑制剂SB431542是否能增加其放射敏感性，并探讨SB431542对细胞受照后DNA损伤应答和细胞周期分布的影响。

1　材料与方法

1.1材料

人非小细胞肺癌细胞H460购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞库；胎牛血清购自美国Hyclone公司；RPMI1640培养基、丙酮酸钠、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、TGF-β1受体抑制剂(SB431542)购自于美国Sigma-Aldrich公司；HEPES缓冲液购自于中国南京旋光科技有限公司；青霉素-链霉素、胰酶消化液、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L)购自于中国碧云天生物技术研究所；抗53BP1兔多克隆抗体和抗磷酸化DNAPKcs(S2056)兔多克隆抗体购自于英国Abcam公司；化学发光剂购自于美国Bio-Rad公司。

NC-nu裸鼠，雄性，8周龄，体重(23±2) g，从苏州大学实验动物中心获得，饲养于苏州大学放射医学与防护学院动物中心，室温为21～26℃，湿度为60％～70％。

1.2方法

1.2.1细胞培养和辐照

H460细胞以适当比例接种于含有10％胎牛血清、2.5 g/L葡萄糖、1 mmol/L丙酮酸钠、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素以及1 mmol/L HEPES (pH=7.2)的RPMI1640培养液中，置于37℃、含5％ CO2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞接种后24 h，更换为含SB431542的新鲜培养液，并培养1 h后换液，采用美国RAD SOURCE RS2000 X-射线机进行照射，能量为160 kVp，剂量率为1.16 Gy/min。

1.2.2结晶紫实验测定细胞增殖

取5000细胞接种于96孔板中，培养24 h后，更换为含有不同浓度SB431542(1、2、5、10 μmol/L)的新鲜培养液。继续培养不同时间(24、48、72 h)后吸出培养液，用PBS洗两遍，加入结晶紫溶液(0.5％)，在室温下孵育15 min后用自来水清洗干净并晾干。然后，每孔加入100μL 0.1mol/L的柠檬酸钠(pH=4.2)/50％无水乙醇在室温下振摇30 min。用酶标仪(BIO-TEK POWERWAVE XS)在540 nm处读取光密度(Optical delnsity, OD)值。

1.2.3克隆形成实验

取对数生长期的细胞制成单细胞悬液接种于60 mm的培养皿中，根据不同的受照剂量，每皿接种100～1000个细胞，每组设3个平行样。24 h后，去除原培养液，更换为含有SB431542(10μmol/L)的新鲜培养液，1 h后换新鲜培养液再照射。继续培养14 d之后，弃培养液，用PBS快速洗3遍，甲醇固定15 min、亚甲基蓝染色30 min，用清水将培养皿洗净晾干。于显微镜下计数含50 个细胞以上的细胞集落。克隆形成率和细胞克隆存活率按如下公式计算：

克隆形成率(％)=(克隆数/接种细胞数)×100％；

细胞克隆存活率=处理组克隆形成率/对照组克隆形成率。

1.2.4流式细胞术检测细胞周期分布和Sub-G1

将H460细胞接种在100 mm培养皿中。24 h后更换为含有SB431542(10 μmol/L)的新鲜培养液，再1 h后换新鲜培养液再照射。在照后5、24、48、72 h时，收集细胞后固定于70％的乙醇中，并储存于−20℃备用。离心细胞悬浮液并用PBS洗两次，再悬浮于含0.1％ NP40和500 µg/mL的RNA酶的700 µL碘化丙啶(100 µg/mL)中，用流式细胞仪(BECKMAN COULTER CYTOMICS FC500)进行分析。采用Multicycle AV for Windows分析细胞周期，CXP analysis分析Sub-G1以评估凋亡水平。

1.2.5免疫荧光检测53BP1和磷酸化的DNAPKcs foci

将H460细胞接种在盖玻片上。用不同方法处理后，在不同时间点用3.7％的甲醛溶液将细胞在室温下固定15 min。用PBS洗去残留的固定液后，用冰冷的0.5％ 的Triton-100溶液(含50 mmol/L NaCl, 3 mmol/L MgCl2,200 mmol/L Sucrose, 10 mmol/L HEPES, pH=7.4)在4℃孵育15 min。用含有5％山羊血清和0.2％脱脂牛奶封闭液在室温下封闭1 h后，用53BP1或phospho-DNA-PKcs抗体分别在室温或37℃条件下孵育45或90 min，再用Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L)二抗在室温下避光孵育45 min。PBS洗涤细胞后，用4', 6'-diamidimo-2- phenylindole (DAPI)(10 μg/mL时)染色2 min，然后用抗淬灭剂（碧云天）封片，并在荧光显微镜(Leica DM2000)下观察计数。对于53BP1 foci的计数，计100个细胞中的foci数目；而对于DNA-PKcs foci，计至少500个细胞中含有foci的阳性细胞率，以含10个或10个以上foci的细胞为阳性。

1.2.6移植瘤实验

裸鼠左后腿内侧皮下注射300万个H460细胞。当肿瘤达到约100 mm3后给予分组处理。20只荷瘤小鼠随机被分为4组，分别是不处理组、单纯加药组、单纯照射组、加药+照射组，每组5只小鼠。加药组小鼠接受腹腔注射SB431542(10 mg/kg)。2 h后对加药+照射组和单纯照射组的小鼠进行肿瘤局部照射(5 Gy)。这样的处理每隔24 h进行一次，连续处理3次。经过连续3 d的处理后，从第4天起开始，每天用游标卡尺按下式测量肿瘤体积。

肿瘤体积=长×宽2×0.52[10]。

1.2.7统计学方法

所有数据都是至少3次独立实验的平均，并用均数加减标准误差表示(±s)。细胞存活和肿瘤体积数据采用Origin 8.0软件的ANOVA法检验分析多个样本均数间的差异，以Turkey Post Hoc检验进行多个样本均数间的多重比较；其余数据两组间的比较采用 Student's t检验。p<0.05被认为两组间的差异有统计学意义。

2　结果

2.1SB431542对H460细胞的毒性

为验证SB431542自身对细胞的毒性作用，本研究分析了经不同浓度的SB431542处理后细胞的增殖能力。如图1所示，与未处理组相比，在所用浓度范围内(1～10 µmol/L)，SB431542处理细胞24 和48 h均对细胞的增殖无显著抑制作用(p>0.05)，而只有10 µmol/L SB431542在处理细胞72 h后对其增殖有20％ 的抑制。因此，考虑到10 µmol/L SB431542在处理H460细胞48 h内并无明显生长抑制作用，以后的实验中均使用10 µmol/L SB431542预处理1 h来抑制细胞的TGF-β通路。

2.2SB431542增加H460细胞的放射敏感性

在克隆形成实验中，本研究发现10 µmol/L SB431542单独处理H460细胞后使其克隆形成率降低了6％ (p<0.05)，然而在扣除了该降低后，SB431542仍然显著增加了H460细胞的辐射敏感性。图2所示的细胞存活曲线为用Origin 8.0软件采用线性二次模型拟合而成。在10％的克隆存活率下，剂量增敏比(RDE)[10]按以下方法计算：

剂量增敏比=为获得10％的克隆存活率所需的受照剂量/在加药条件下为获得10％的克隆存活率所需的受照剂量。

由此计算出H460的RDE为1.15±0.02 (p< 0.05)。因为RDE显示的是在无SB431542下获得10％存活率所需受照剂量与在有SB431542下获得同样存活率所需受照剂量的比值，因此RDE如果大于1则表明在有SB431542时所需受照剂量较小，也即是SB431542具有增敏效果。RDE越大，增敏效果越好。所以这个结果表明10 µmol/L SB431542增加了H460细胞的辐射敏感性。

2.3SB431542抑制TGF-β1通路后对H460细胞受照后周期和凋亡的影响

为了确定SB431542降低H460细胞受照后克隆存活能力的增敏机制，本研究通过流式细胞术检测细胞周期来探究SB431542是否改变了细胞受照后的周期分布，并通过检测SubG1来评估SB431542是否增加辐射诱导的细胞凋亡。如图3所示，SB431542单独处理细胞并未明显改变细胞周期分布，但在SB431542联合5 Gy的射线处理下，与单独照射组相比，在处理后24 h，有更多的细胞阻滞在S期，而在48 h后，细胞出现了更明显的G2/M期阻滞，提示SB431542联合辐射可能造成了更多残留的DNA双链断裂，从而导致了更严重的细胞周期阻滞。另外，通过测定Sub-G1，本研究发现SB431542单独处理细胞后不同时间点(5、24、48、72 h)并未导致细胞凋亡，5和8 Gy的X-射线照射在照后直到72 h也未引起具有统计学意义的凋亡增加；SB431542联合辐照后，与5 Gy和8 Gy单独受照组相比，SB431542联合辐射组也未增加细胞凋亡（图4），表明SB431542对H460细胞的辐射增敏作用不是来自于对细胞受照后发生凋亡的促进。

2.4SB431542延缓了H460细胞受照后的DNA损伤修复

为了进一步探讨抑制TGF-β1使H460细胞放射敏感性增加的相关机制，并解释SB435142联合辐射组中更严重的细胞周期阻滞，本课题首先研究了作为DNA双链断裂标记的53BP1 foci[14]在细胞受照后出现和消失的动力学过程。结果显示，照射前有无SB431542处理并不引起含有53BP1 foci的阳性细胞比例的变化（数据未显示），然而当对平均每个细胞中的53BP1 foci数进行计数时，却发现与单纯受照射细胞在照射后30 min达到峰值不同，SB431542预处理的细胞受照后15 min，其单个细胞中的53BP1 foci数即达到了峰值，提示SB431542加速了细胞受照后的DNA损伤应答。并且，尽管在照射后1 h，SB431542预处理的细胞中残留的53BP1 foci的数目小于单纯受照射细胞，但照射后4 h，这个趋势发生了逆转，至少在照射后8 h之内，SB431542预处理的细胞中残留的53BP1 foci的数目大于单纯受照射细胞，提示SB431542联合辐射处理的细胞中残留的DNA双链断裂比单纯照射细胞要多（图5）。

为了进一步明确SB431542预处理导致细胞受照后残留的DNA损伤增多的原因，本课题又研究了SB431542预处理是否影响细胞在受照后非同源末端链接通路的激活。以磷酸化的DNA-PKcs foci作为非同源末端链接通路的标记[15]，本研究发现SB431542预处理导致受照后含有DNA-PKcs foci的阳性细胞率至少在1 h之内显著低于单纯受照射细胞，而这种差异在照射后6 h消失了。这提示SB431542削弱了细胞受照射后短期内的非同源末端链接修复能力。

2.5SB431542在体内对H460移植瘤有增敏作用

为了进一步研究该抑制剂在体内是否和辐射有协同作用，本研究进行了裸鼠荷瘤的体内实验。结果显示，与未受任何处理的对照组相比，单纯SB431542处理并未显著降低肿瘤的生长(p>0.05)，但连续3次5 Gy的局部照射包括单独照射和加药联合照射均显著地抑制了肿瘤的生长(p<0.001)（图7a）。而与单独照射组相比，SB431542联合照射在处理后第5天到第12天之间，肿瘤的体积甚至发生了明显的缩小(p<0.001)（图7b），提示SB431542在体内也具有放射增敏作用。然而由于对肿瘤只进行了三次处理，12 d之后肿瘤恢复生长，单纯照射组和加药照射组之间的差异慢慢缩小了（图7b）。

3　讨论

肺癌放疗所用的最大剂量受限于周围肺组织的耐受性。肺损伤和肺纤维化是肺癌病人经受放射治疗后的常见副作用。研究表明肺癌细胞受照后大量释放的TGF-β1与正常肺组织的损伤和纤维化密切相关[16]。研究还发现，利用患者放疗后4周内血浆TGF-β1的升高能准确地预测非小细胞肺癌病人是否有并发放射性肺毒性的危险[17]。因此，TGF-β1可能作为预防RILT的一个有效标靶。现已有研究显示大黄提取物可能通过降低TGF-β1和IL-6的水平来减少RILT，并改善肺功能[18]。

另一方面，对于乳腺癌和胶质母细胞瘤的研究显示，抑制TGF-β1通路能增加这些肿瘤细胞的放射敏感性[10,12]。因此如果抑制TGF-β1通路也能增加肺癌细胞的辐射敏感性，抑制肺癌的生长，那么在临床上将会有一举两得的效果。最近的研究显示，用TGF-β1受体激酶的选择性抑制剂LY364947能增加A549和H1299等肺癌细胞的放射敏感性[11]。而本研究探索了另外一个TGF-β1受体抑制剂，SB431542对另一株肺癌细胞系，H460细胞是否具有放射增敏作用。结果发现，在照射前用SB431542选择性抑制TGF-β1通路后，H460非小细胞肺癌细胞的放射敏感性增加（图2）。对SB431542增加H460细胞的放射敏感性的机制进行研究后发现，SB431542预处理加快了细胞受照后的DNA损伤应答反应，表现为53BP1 foci的数目在照后15 min而不是30 min即达到峰值，显示抑制TGF-β1通路加快了细胞受DNA损伤后招募损伤识别修复蛋白到损伤位点的速度。然而与单纯受照射细胞相比，SB431542并没有降低53BP1 foci的数目，提示SB431542不是通过抑制细胞受照后招募的DNA损伤识别蛋白的量来达到辐射增敏作用的。这与之前报道的在受照前抑制乳腺癌细胞的TGF-β1导致H2AX磷酸化的减少不同[10]。但是，尽管SB431542快速启动了细胞受照后的DNA损伤应答反应，然而到照射后4～8 h，SB431542联合辐射处理的细胞中残留53BP1 foci的数目却显著高于单纯受照细胞（图5），提示照射前抑制TGF-β1通路可能降低了细胞修复DNA双链断裂的能力。进一步的研究显示，SB431542抑制了细胞照射后至少1 h内的磷酸化DNA-PKcs foci的形成（图6），提示抑制TGF-β1通路降低了细胞通过非同源末端链接通路修复DNA损伤的能力。这可为SB431542联合照射处理的细胞中存在更多残留的DNA损伤提供合理的解释。而正因为有更多残留的DNA损伤，才导致SB431542联合放射处理的细胞与单纯照射的细胞周期分布不同，存在更多的S期和G2/M阻滞。这些结果提示TGF-β1信号通路与DNA损伤应答通路并非互独立，而是存在相互作用的[9,19]。

本研究更多的数据表明，抑制TGF-β1通路增加H460细胞的放射增敏性与细胞凋亡无关（图4），细胞凋亡在SB431542对细胞的增敏作用中并未有贡献。这可能与非小细胞肺癌细胞具有凋亡通路缺陷有关[20]，而抑制TGF-β1通路并未改善该缺陷。

体内荷瘤实验证明，与空白对照组相比，单纯加药组对肿瘤的生长并无显著抑制，而单纯照射和加药照射却都能显著抑制肿瘤的生长。并且相对于单纯照射组，加药照射组的肿瘤在第5至12天更是显著减小，显示出SB431542的放射增敏作用。但本研究也观察到照射组和加药照射组的这种差异在后期消失了。分析其原因，可能是由于处理次数不够（只有3次），后期肿瘤本身增殖重新加快造成的。然而，即使这样，与对照组和单纯加药组相比，SB431542联合辐射组和单纯辐射组的肿瘤仍然小很多，表明肿瘤得到了有效的控制。

本研究证实了照射前抑制TGF-β1通路增加H460非小细胞肺癌细胞的放射敏感性，这支持了关于抑制TGF-β1信号可能提高肺癌放疗疗效的概念。这种放射增敏作用可能是通过改变DNA损伤应答反应、抑制非同源末端修复DNA双链断裂的能力及改变细胞周期分布来实现的，与细胞凋亡无关。另外，已有研究还发现SB431542能够抑制放疗导致的肿瘤细胞迁移能力和侵润能力的增加[21]。因此SB431542在非小细胞肺癌的放疗中有可能有潜在的应用前景。

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Corresponding author:Ph.D. YANG Hongying, professor, E-mail: yanghongying@suda.edu.cn

收稿日期：初稿2015-10-22；修回2015-12-30

通讯作者：杨红英，博士，教授，E-mail: yanghongying@suda.edu.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010202

中图分类号Q691，TL71

基金资助：国家自然科学基金(31270898, 11335011)、江苏省教育厅省属高校自然科学研究重大项目(12KJA310005)、江苏高