辐射诱导分子lnc-RI稳定敲低细胞系建立及其功能

常 诚沈丽萍张学清李 琳李孝鑫王治东周平坤

1（南华大学公共卫生学院 衡阳 421000）

2（军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850）



辐射诱导分子lnc-RI稳定敲低细胞系建立及其功能

常 诚1,2沈丽萍2张学清2李 琳2李孝鑫2王治东2周平坤1,2

1（南华大学公共卫生学院 衡阳 421000）

2（军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850）

摘要制备lnc-RI干涉表达的慢病毒颗粒，建立lnc-RI稳定下调的HeLa细胞系，探索lnc-RI对细胞辐射敏感性的作用。首先将lnc-RI特异性干涉序列插入干涉表达载体pGLV2中，并制备慢病毒颗粒；然后，将慢病毒颗粒感染HeLa细胞，建立lnc-RI稳定下调的细胞系，并通过RT-PCR检测不同干涉序列对lnc-RI表达的干涉效果；最后，通过平板克隆形成实验分析lnc-RI表达下调对HeLa细胞放射敏感性的影响。结果显示，成功制备了携带lnc-RI干涉序列的慢病毒颗粒，并成功感染HeLa细胞，通过RT-PCR实验鉴定获得两株lnc-RI稳定敲低细胞系。克隆形成实验发现，与对照相比，lnc-RI敲低的HeLa细胞系的放射敏感性增加。因此，初步证实lnc-RI表达下调增加HeLa细胞放射敏感性。

关键词长链非编码RNA，lnc-RI，慢病毒，RNA干涉，电离辐射

wangzhidong1977@126.com

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81573083 and 81402631)

First author: CHANG Cheng, female, was born in June 1987 and graduated from North China University of Science and Technology in 2012. Now she is a master candidate of University of South China, majoring in public health and preventive medicine and focusing on health toxicology. E-mail: 1109308002@qq.com

professor, E-mail: wangzhidong1977@126.com

Received 17 September 2015; accepted 20 October 2015

Establishment of stable knock-down cell lines and function study of lnc-RI, a radiation-induced gene

CHANG Cheng1,2SHEN Liping2ZHANG Xueqing2LI Lin2LI Xiaoxin2WANG Zhidong2ZHOU Pingkun1,2

1(College of Public Health, University of South China, Hengyang 421000, China)
2(Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

ABSTRACT To prepare the lentivirus granules interfering lnc-RI and establish HeLa cell lines consistently down-regulating lnc-RI, as well as discover its effects on radiation damage, the lentivirus granules bearing various interfering sequences were prepared by lnc-RI carrying specific interfering sequences in to interfering plasmid pGLV2. The estable cell lines were established after infecting HeLa cells with lentivirus granules. RT-PCR was employed to determine the inhibitory effects of various interfering sequences on lnc-RI expression. DNA damage of the established estable cell lines were induced by ionizing radiation sensitivity of the established cell lines which weredetermined by colony formation assay. The results showed that the lentivirus granules bearing various interfering sequences were successfully prepared. The estable HeLa cell lines infected by lentivirus were obtained and lnc-RI expression levels was down-regulated. The results of colony formation assay showed that radiation sensitivity of the estable cell lines increased when treated with each dose gamma ray irradiation.

KEYWORDS Long non-coding RNA, lnc-RI, Lentivirus, RNA interference, Ionizing radiation

CLC TL71

长链非编码RNA (Large non-coding RNA, lncRNA)是一类转录本长度大于200个核苷酸、绝大部分没有长阅读框架、没有编码蛋白质的功能、但像mRNA一样具有帽式结构和poly A尾巴的基因转录产物[1]。随着基因组技术的发展，发现在人类基因组中大部分lncRNA存在转录现象，但与编码蛋白质的基因序列相比，其表达水平相对较弱[2]。lncRNA自身的表达水平不仅受到转录及转录后调控机制的严密调节[3]，它还具有调节多种重要的细胞生命活动的生物学功能，如lncRNA能在表观遗传、基因组印记、转录及转录后水平上调控基因表达、参与X染色体沉默、染色体剂量补偿效应以及染色质修饰、调节细胞周期、细胞分化、维持细胞结构的完整性、 细胞内物质转运、干细胞重新编程和热休克反应等重要生命活动过程与人类疾病的发生、发展也有着密切联系[4-7]。lncRNA种类众多，目前功能明确的lncRNA数量很少。

Lnc-RI是本实验室前期发现的辐射诱导表达的功能未知基因[8]，目前尚未见文献对lnc-RI功能进行报道。生物信息学分析表明其为一种长链非编码RNA(Gene ID: 401296)，定位于人7p22.3，全长1423 bp，我们将其命名为lnc-RI (lncRNA radiation induced)。本研究构建靶向lnc-RI的shRNA慢病毒颗粒并建立lnc-RI稳定敲低的HeLa细胞系，初步探索lnc-RI对辐射敏感性的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞、质粒和菌株

HEK293T细胞（人胚肾细胞）和Hela细胞（宫颈癌上皮细胞）为本实验室保存。慢病毒载体包装系统（含pGag/Po1、pRev、pVSVG及穿梭质粒pGLV2）由上海吉玛公司构建制备，采用TIANGEN公司的高纯度质粒小提中量试剂盒（离心柱形）提取质粒DNA。大肠杆菌 Top10感受态细胞、嘌呤霉素为本室保存。

1.1.2试剂

反转录试剂盒购自TaKaRa公司；DNA连接酶、限制性内切酶(AgeI, EcoRI) 购于MBI Fermentas；琼脂糖DNA凝胶纯化回收试剂盒购买于Biomed；高纯度质粒小提中量质粒提取试剂盒购自于TIANGEN公司，质粒体转染试剂RNAi-Mate购自吉玛公司；TRIZOL购自ambion公司；细胞培养基1640、H-DMEM及胎牛血清均为Gibco公司产品。

1.1.3特异性干涉序列和 PCR引物设计及合成

表1　shRNA对应靶序列和lnc-RI及β-actin引物与探针序列Table 1 The shRNA sequence and primer, probe sequence of lnc-RI and β-actin

1.2方法

1.2.1细胞培养

293T细胞用含10％胎牛血清、0.1％青霉素和链霉素的H-DMEM培养基，HeLa细胞用含10％胎牛血清、0.1％青霉素和链霉素的1640培养基，5％ CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。

1.2.2干涉载体构建与鉴定

对载体LV2进行双酶切（内切酶为AgeI和EcoRI），经琼脂糖电泳回收新合成的载体DNA。将合成的目的DNA进行退火反应，然后用DNA连接酶将形成的双链DNA与回收的载体DNA进行连接反应（反应条件：22℃，1 h）。连接后的产物转入感受态细胞（大肠杆菌 Top10）中，挑取3−5个单克隆菌落并进行PCR鉴定，挑选鉴定阳性的克隆进行摇菌。根据质粒提取试剂盒提取质粒，用 EcoRI酶对提取的质粒用进行单酶切鉴定，酶切鉴定正确的送去公司进行基因测序分析。

1.2.3包装、收取慢病毒颗粒

293T细胞在15cm培养皿中培养至60％～70％融合时除去培养液，加8 mL无血清的H-DMEM培养液。取一支高压灭菌的10 mL离心管，加入1.5 mL无血清无抗生素的H-DMEM培养基，然后加入含目的序列的重组干涉质粒pGLV2和不同的包装质粒（pGag/Po1、pRev和 pVSVG），混匀，然后再取一支高压灭菌的10 mL离心管，加入1.5 mL无血清无抗生素的H-DMEM培养基，再加入300 μL RNAi-Mate，静置5 min，然后将两管混合，静置15 min。将混合物加到含有8 mL培养液的15 cm培养皿中，在5％ CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养6 h后，更换为18 mL含10％血清的H-DMEM新鲜培养液。继续培养72 h后，将培养皿中细胞上清液吸至50 mL离心管，在4℃，4000 r/min，离心4 min后，将离心管上清液倒入50 mL注射器内，用0.45 μm过滤器过滤。滤液经4℃，20000 r/min，2 h离心将浓缩液收集分装，−80℃保存（因慢病毒干涉质粒无绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)元件，故采用LV2-GFP质粒作为对照，平行操作作为参考）。

按3×104个细胞/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37℃、5％ CO2条件下培养24 h。将同时获得的对照病毒LV2-GFP原液10 μL，用含10％ FBS 的H-DMEM培液10倍稀释3～5个梯度，加入终浓度为5 μg/mL的Polybrene促进感染。然后除去培养液，按100 μL/孔加入稀释的不同梯度的病毒液，同时设立阴性对照和空白对照组，于5％ CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养24 h。吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入100 μL 含10％ FBS的HDMEM培养液，于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养72 h。利用荧光显微镜分析GFP 表达情况，并计算病毒滴度(TU/mL)：

观察平时的语文教学，我们就会发现有些学生的预习不主动，效果差，这直接影响了课堂教学效果。由于没有预习或预习效果差，上课时他们没法跟上预习的同学的思维，无法跟上老师的教学节奏，思考不深入，回答不深刻、不全面。因此，指导学生掌握科学的预习方法尤为重要。我觉得应从以下方面进行预习：

病毒滴度=(P×N/100×V) ×1/FD。

其中：P = ％GFP+cells；N 为转染时的细胞数；V 为每孔加入病毒稀释液体积(μL)；FD为稀释因子(Dilution factor)。

1.2.4lnc-RI稳定下调表达细胞系的构建及PCR鉴定

实验前一天分别接种3×105个/孔HeLa细胞到6孔细胞培养板中，所加培养基为2 mL。培养24 h后，将携带不同lnc-RI干涉序列的LV2-NC、LV2-lnc-RI-1和LV2-lnc-RI-2的慢病毒上清按感染复数(Multiplicity of infection, MOI)为20，去感染HeLa细胞，同时每孔加入终浓度为10 μg/mL的Polybrene以促进慢病毒的感染力。于37℃、5％ CO2培养箱中温育24 h后，因慢病毒感染成功的细胞具有嘌呤霉素抗性，所以更换含1.5 g/mL嘌呤霉素、10％ FBS的1640培养液以筛选稳定细胞系。维持含1.5 g/mL嘌呤霉素药物继续培养3～5天，不再死亡的细胞即为lnc-RI稳定敲低表达细胞系，替换含嘌呤霉素(0.5 g/mL)细胞培养液维持培养。将建立的稳定细胞系分别命名为HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1和HeLa-LV2-lnc-RI-2。

将病毒感染的细胞系根据Trizol法提取细胞总RNA，按TAKARA试剂盒操作说明经反转录和PCR检测lnc-RI 表达。PCR条件为95℃ 3 min、95℃10 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，40循环，所得实验结果经2−△△CT法计算其相对定量值。

1.2.5细胞平板克隆形成实验

取对数生长期的细胞HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1、HeLa-LV2-lnc-RI-2进行细胞计数，分别将三种细胞各按500个/孔细胞数接种于6孔细胞培养板。接种后24 h，分别给与0、1、2、4、6 Gy60Co γ-射线照射处理（剂量率：104.89 cGy/min），每种细胞每个剂量点接种3个复孔。照射后继续培养，隔3～4d换一次液。当细胞培养板中出现肉眼可见的克隆时（约12d）倒掉培养液，用PBS洗2次，甲醇固定30 min，去固定液，自然风干后Giemsa染色30 min，流水清洗后室温晾干，统计细胞克隆数（普通显微镜下计数≥50个细胞的单克隆）。计算细胞抑制率：细胞克隆抑制率=照射组克隆数目/未照射组克隆数目× 100％。

1.2.6数据处理

所有实验均重复3次，采用SPSS17.0软件对所得数据进行统计学分析，组间比较采用t-test，p<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1干涉载体构建及病毒包装

在pGLV2载体多克隆位点处插入包含不同干涉序列的双链DNA片段，所得的重组质粒进行测序分析，结果比对表明：插入的干涉序列与理论设计的目的序列一致。将成功构建的干涉载体命名为LV2(U6/Puro)-lnc-RI-1和LV2 (U6/ Puro)-lnc-RI-2。

我们采用的pGag/Po1、pRev、pVSVG和pGLV2慢病毒系统共转染293T细胞，24 h后荧光显微镜下观察，同批次转染LV2-GFP质粒的细胞大部分可见绿色荧光表达，说明慢病毒干涉体系已经顺利转染细胞。换取含有10％ FBS的H-DMEM培养液培养72 h，收集细胞上清，经浓缩后获得慢病毒上清。将制备的慢病毒颗粒分别命名为LV2-NC、LV2-lnc-RI-1和LV2-lnc-RI-2。将3×104个/孔的293T细胞接种于96孔板中，加入不同稀释倍数的病毒上清，培养24 h。吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加100 µL 含10％ FBS的H-DMEM培液，培养72 h，收集细胞，利用同批次GFP 荧光表达比例结合稀释倍数计算病毒滴度。如图1所示，稀释倍数为10−2和10−3的细胞感染效率接近100％，按照10−3为最低的饱和滴度，经计算分析，LV2-NC、LV2-lnc-RI-1 和LV2-lnc-RI-2的病毒滴度约为1×109TU/mL。

2.2稳定干涉细胞系建立及干涉效果鉴定

将携带不同特异性干涉序列LV2-lnc-RI-1、LV2-lnc-RI-2和LV2-NC分别感染 Hela细胞(20 MOI)，感染后24 h加入含有嘌呤霉素(1.5 g/mL)的培养液继续培养3～5 d，细胞不再死亡，获得稳定细胞系。将各个感染慢病毒颗粒的Hela细胞系分别命名为HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1和Hela-LV2-lnc-RI-2。

将上述几种感染病毒颗粒的Hela细胞系HeLa-LV2-NC、HeLa-LV2-lnc-RI-1和HeLa-LV2-lnc-RI-2分别提取总RNA后进行实时定量 PCR，以β-actin作为内参进行分析，结果如图2所示。与对照组HeLa-LV2-NC细胞相比，干涉细胞系HeLa-LV2-lnc-RI-1和HeLa-LV2-lnc-RI-2的Lnc-RI的相对表达量分别下降为0.73和0.16，说明建立的两个慢病毒干涉细胞系Lnc-RI的表达均受到不同程度的抑制，慢病毒干涉细胞系HeLa-LV2-lnc- RI-1 和HeLa-LV2-lnc-RI-2为有效的抑制Lnc-RI基因表达的细胞模型。

2.3细胞平板克隆形成实验

为了分析lnc-RI对HeLa细胞辐射敏感性的影响，我们进行细胞克隆形成实验。结果如图3所示，对照细胞LV2-NC受照1、2、4、6 Gy剂量后，克隆数目分别为未照射组的95.7％、89.4％、68.2％、30.1％；HeLa-LV2-lnc-RI-1和Hela-LV2-lnc-RI-2细胞经l、2、4、6 Gy60Co γ-射线照射后，克隆数目分别为未照射组的92.1％、81.3％、63.0％、23.8％ 和90.5％、79.1％、53.2％、20.7％。统计学分析表明，在6 Gy以内的照射条件下，与对照细胞系相比，lnc-RI表达下调的HeLa细胞照射后克隆形成能力下降，提示lnc-RI表达下降增加HeLa细胞的放射敏感性。

3　讨论

随着芯片技术的发展和人类基因组测序的完成，越来越多的长链非编码RNA为人们所熟知。到目前为止，已有100000 多种lncRNA的转录本被发现[9-10]，但相对于蛋白质编码序列以及各种小分子RNA，对于lncRNA 的研究相对较少。随着研究深入，越来越多的lncRNA的功能将被揭示。电离辐射可以造成严重的DNA损伤反应(DNA-damage response, DDR)，如：细胞DNA双链的断裂，碱基的错配与缺失，细胞周期检查点异常，细胞发生凋亡等，是发生染色体畸变、基因突变、细胞异常死亡的主要原因之一[11]。开展辐射相关lncRNA研究将有助于进一步阐明辐射诱导细胞损伤的分子机制。有研究发现，lincRNA-p21、PANDA1 (p21 associated ncRNA DNA damage activated)等 lncRNA分子参与辐射诱导细胞损伤过程[12-13]。但是，关于电离辐射相关lncRNA的研究还很少。

本研究中的lnc-RI是本实验室前期研究筛选到的一种辐射诱导表达的一种长链非编码RNA (Gene ID: 401296)[8]。目前，关于该分子没有任何功能研究报道，我们前期研究首次发现电离辐射可以诱导lnc-RI表达上调，提示其可能参与电离辐射诱导损伤过程。本研究采用慢病毒系统建立靶向lnc-RI的干涉细胞系，并初步探索lnc-RI在辐射诱导细胞损伤中的作用。采用生物信息学方法结合RT-PCR鉴定，获得两条靶向lnc-RI的干涉序列，并成功制备其慢病毒颗粒，获得两株lnc-RI特异性下调的干涉细胞系，lnc-RI抑制效果分别为对照组的73％和16％。随后采用克隆形成实验，探索lnc-RI对辐射诱导细胞损伤的作用。结果分析表明，与未照射细胞相比，6 Gy照射对HeLa-LV2-lnc-RI-1、HeLa-LV2-lnc-RI-2的克隆形成抑制率分别为23.8％ 和20.7％，明显低于对照细胞系(30.1％)，这表明，下调lnc-RI表达增强HeLa细胞的辐射敏感性。结合lnc-RI为电离辐射诱导表达，提示lnc-RI具有抗辐射损伤的作用。本研究筛选获得靶向功能未知分子lnc-RI的干涉序列，并成功制备慢病毒颗粒，建立lnc-RI稳定下调的HeLa细胞系，初步发现lnc-RI的抗辐射作用。

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Corresponding author:ZHOU Pingkun, doctoral tutor, professor, E-mail: zhoupk@bmi.ac.cn; Ph.D. WANG Zhidong, associate

收稿日期：初稿2015-09-17；修回2015-10-20

通讯作者：周平坤，博士生导师，研究员，E-mail: zhoupk@bmi.ac.cn；王治东，副研究员，博士，E-mail:

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81573083)和国家自然科学基金青年项目(81402631)资助

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010203

中图分类号TL71

第一作者：常诚，女，1987年6月出生，2012年毕业于华北理工大学，现为南华大学在读研究生，公共卫生与预防医学专业，研究方向卫生毒理学，E-mail: 1109308002@qq.com