生物功能化中空纳米二氧化硅微球的构建及其对蛋白质的分离纯化

邹雪艳，何晓锋，王　朋，郭静玉，刘　锦*

( 1．河南大学纳米材料工程研究中心，河南开封475004; 2．河南大学民生学院，河南开封475004; 3．河南大学化学化工学院，河南开封475004)



生物功能化中空纳米二氧化硅微球的构建及其对蛋白质的分离纯化

邹雪艳1，何晓锋2，王朋2，郭静玉3，刘锦3*

( 1．河南大学纳米材料工程研究中心，河南开封475004; 2．河南大学民生学院，河南开封475004; 3．河南大学化学化工学院，河南开封475004)

摘要:本文作者通过水热法合成了中空SiO2-SH纳米微球，然后直接用其吸附Ni2+，从而形成SiO2-SH-Ni2+复合材料，以此材料为载体，可以将以组氨酸为标签的( His-tagged)的融合蛋白直接从细胞裂解液中进行分离纯化，实验结果表明，该微球适合于His-tagged融合蛋白的分离纯化．

关键词:中空;二氧化硅;组氨酸;亲和分离

纳米SiO2是一种生物相容性材料，通过表面基团修饰［1－3］可以赋予纳米SiO2新的表面特性，从而提高其在纳米药物输运与控释，蛋白质分离与纯化等方面的应用［4－8］．蛋白质的分离纯化［9－10］，特别是低丰度蛋白质的纯化，在蛋白组学领域是一个重要课题．许多纯化方法采用的分离步骤是基于特定配体之间的相互作用和亲和标记蛋白，最常见的亲和标记蛋白是以六聚组氨酸为标签的His-tagged蛋白［11－13］，His-tagged重组质体被植入大肠杆菌体内，并用常规的方法进行蛋白的表达［14］．然而，这些合成方法仍有一定的局限性［15－16］，如预处理需要删除细胞碎片和胶体污染物，致使操作时间较长．随着纳米材料的发展，纳米微球或颗粒［17］作为一种新兴的载体被用于蛋白质的分离．例如Au/Fe3O4纳米粒子改性后与Ni2+-NTA结合，并应用于Histagged蛋白的分离［18］，当前这种方法的主要限制是微粒的表面积有限以及表面金属粒子密度较低，从而导致纯化效率较低．中空纳米SiO2微球具有较大的比表面积，并且通过水热法一步制得SiO2-SH纳米微球克服了接枝率低的弊端，因此以SiO2-SH中空纳米微球作为载体可以有效的提高表面螯合金属离子的密度，从而提高分离目标蛋白的能力．本文作者采用水热法制备了中空SiO2-SH纳米微球，将其吸附Ni2+形成SiO2-SH-Ni2+微球，用于Histagged蛋白的分离纯化．

1　实验部分

1．1试剂与仪器

正硅酸四乙酯( TEOS，天津市福晨化学试剂厂) ;巯基丙基三甲氧基硅烷( MPS，95%)购自Alfa-Aesar公司;十六烷基三甲基溴化铵( CTAB，≥98．0%)购自化学试剂国药控股有限公司;γ-( 2．3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷( GPTMS)购自阿拉丁化学有限公司;三乙基胺( TEA)天津市科密欧化学试剂有限公司．

样品的形貌及组成用透射电子显微镜( TEM，JEOL JEM-2010型)、热重分析仪( TG，TGA/SDTA851e型)及傅立叶变换红外光谱仪( IR，AVATAR360型)进行检测．捕获的His-tagged蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测( SDSPAGE，Poer PAC 300，郑州宝赛科贸有限公司)，稳压电压是70 V，分离电压是120 V．

1．2实验过程

1．2．1 SiO2-SH微球的制备

在50 mL三颈瓶中分别加入17 mL水、2．8 mL无水乙醇和0．03 g CTAB，搅拌15 min;逐滴加入1．1 mL TEA，室温下搅拌;升温至60℃，搅拌下缓慢滴入1．4 mL TEOS和0．14 mL MPS，搅拌反应3 h;将溶液转入高温反应釜中，在110℃反应48 h，自然冷却至室温;离心分离，固体产物用无水乙醇和盐酸分别洗涤数次，在60℃烘干24 h，得到SiO2-SH样品．

1．2．2 SiO2-SH-Ni2+的制备

取3 mg SiO2-SH样品加入50 mL试管中，然后加入50 mL 2 mol/L NiCl2溶液，超声分散，于25℃水浴振荡反应24 h，使其充分吸附Ni2+;离心分离，将固体产物用去离子水超声洗涤数次，然后分散于25%(体积分数)的乙醇溶液中，于4℃冰箱中保存备用．

1．2．3 His-tagged LOV蛋白的分离纯化

十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDSPAGE)是蛋白质分析中最常用的技术，可用于定性测定和分析蛋白质的相对分子质量、种类和数量．十二烷基磺酸钠可将蛋白质大分子变性，并与蛋白质分子结合形成带负电荷蛋白质-SDS复合体．在电场作用下，蛋白质-SDS复合体沿着聚丙烯酰胺凝胶形成的分子筛向电场的正极方向移动，从而可根据蛋白质相对分子质量的大小将其分开［19］，分开后的具有不同相对分子质量的蛋白质在凝胶上呈现对应的条带，与Marker呈现的标准条带相对比就可判断目标蛋白质的相对分子质量．

His-tagged LOV蛋白分离纯化的步骤如下:首先用将SiO2-SH-Ni2+样品用破菌buffer( 20 mmol/L Tris-HCl，含0．2 mol/L NaCl)超声洗涤3次;然后将这些样品加入到1 500 μL细胞裂解液中，在摇床上( 90 r/min，4℃)孵化2 h;接着将捕获了目标蛋白的SiO2-SH-Ni2+样品进行离心，并将沉淀用破菌buffer洗涤数次以去除表面残留的蛋白;最后将捕获的His-tagged LOV蛋白用300 μL咪唑( 1 mol/L)进行洗脱，离心后上清液即为纯化的His-tagged LOV蛋白，对目标蛋白进行SDS-PAGE分析．剩余的SiO2-SH-Ni2+样品用EDTA和NiCl2溶液处理后重复分离目标蛋白3次．

2　SiO2　-SH微球的表征

2．1 TEM图分析

图1为制备的SiO2-SH和SiO2-SH-Ni2+样品的TEM．由图1a和1b可以看出，制备的SiO2-SH样品为中空纳米微球，粒径均一，分散性较好．微球的平均粒径约为45 nm，壳层厚度约为10 nm．从图1c可以看出，表面吸附Ni2+后，制备的微球形貌保持不变，仍为中空纳米微球．

图1　SiO2-SH( a，b)和SiO2-SH-Ni2+( c)样品的TEM图Fig．1 TEM images of the as-prepared SiO2-SH( a，b) and SiO2-SH-Ni2+( c)

2．2 FT-IR图分析

图2为制备SiO2-SH样品的FT-IR图，从图中可以看出，1 097、941、797、460 cm－1处的吸收峰分别对应Si－O－Si的反对称伸缩吸收、对称伸缩吸收及弯曲振动吸收; 1 652 cm－1处为H－O－H的弯曲振动峰，这是由于纳米SiO2表面吸附水所致［20］; 3 426 cm－1的宽峰是结构水－OH反对称伸缩振动峰; 2 953 和2 876 cm－1处分别出现了甲基、亚甲基的伸缩振动峰; 1 472 cm－1处出现了与硫相连的亚甲基的特征吸收峰［21］，间接说明了二氧化硅表面修饰了－SH基团．

图2　SiO2-SH样品的FT-IR图Fig．2 FT-IR spectrum of the prepared SiO2-SH sample

2．3 TG图分析

图3为制备SiO2-SH样品的热重图，从图中可以看出，室温～800℃有明显的失重．其中，室温～250℃，失重率为4．7%，这主要是由于样品表面吸附水高温下脱水所致; 300～700℃样品失重率约为15．0%，主要来自于表面修饰剂的热分解所致，间接说明制备的SiO2-SH微球表面修饰了－SH基团．

图3　制备SiO2-SH样品的热重曲线Fig．3 TG curve of the as-prepared SiO2-SH

2．4 SDS-PAGE电泳分析

图4为制备SiO2-SH-Ni2+样品分离His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2为混合蛋白，泳道3为样品分离Histagged LOV蛋白的电泳条带．从图4泳道1可以看出混合蛋白中既含有His-tagged LOV蛋白，也有其他杂质蛋白．通过样品纯化后，制备的样品可以特异性的分离纯化His-tagged LOV蛋白，因而未出现其他非特性条带(图4泳道3)，说明制备的样品对目标蛋白具有较好的选择性．

图4　SiO2-SH-Ni2+样品分离His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE电泳图Fig．4 SDS-PAGE of separated His-tagged LOV proteins by the as-prepared SiO2-SH-Ni2+

图5为制备SiO2-SH-Ni2+样品分离连续4次分离纯化His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为混合蛋白，泳道2为Marker，泳道3为SiO2-SH第1次分离，泳道4为SiO2-SH第2次分离，泳道5为SiO2-SH第3次分离，泳道6为SiO2-SH第4次分离．从图中可以看出，制备的样品循环使用4次均对His-tagged LOV具有较好的分离效果，说明制备的样品可应用于目标蛋白的分离纯化，特异性较好．

图5　SiO2-SH-Ni2+样品连续4次分离纯化His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE电泳图Fig．5 SDS-PAGE of separated His-tagged LOV proteins by the as-prepared SiO2-SH-Ni2+for four times

3　结论

本文作者合成了SiO2-SH-Ni2+中空纳米微球，并用其分离His-tagged LOV蛋白，实验结果验证制备的SiO2-SH-Ni2+材料对目标蛋白的分离效果好，再生能力强，非常适合于His-tagged融合蛋白的亲和分离．

参考文献:

［1］SALMIO H，BRÜHWILER D．Distribution of amino groups on a mesoporous silica surface after submonolayer deposition of aminopropylsilanes from an anhydrous liquid phase ［J］．J Phys Chem C，2007，111( 2) : 923－929．

［2］邹雪艳，赵彦保，李宾杰．不同形貌纳米二氧化硅的制备及形成机理研究［J］．化学研究，2011，22( 4) : 7－10．

［3］SAYARI A，HAMOUDI S．Periodic mesoporous silicabased organic-inorganic nanocomposite materials ［J ］．Chem Mater，2001，13( 10) : 3151－3168．

［4］JOVANOVIC A V，FLINT J A，VARSHNEY M，et al．Surface modification of silica core-shell nanocapsules: biomedical implications ［J］．Biomacromolecules，2006，7 ( 3) : 945－949．

［5］GERION D，PINAUD F，WILLIAMS S C，et al．Synthesis and properties of biocompatible water-soluble silica-coated CdSe/ZnS semiconductor quantum dots ［J］．J Phys Chem B，2001，105( 37) : 8861－8871．

［6 ］SALIS A，MELONI D，LIGAS S，et al．Physical and chemical adsorption of mucor javanicus lipase on SBA-15 mesoporous silica．Synthesis，structural characterization，and activity performance ［J ］．Langmuir，2005，21 ( 12) : 5511－5516．

［7］KISLER J M，DÄHLER A，STEVENS G W，et al．Separation of biological molecules using mesoporous molecular sieves ［J ］．Micropor Mesopor Mat，2001，44/45( 6) : 769－774．

［8］MOELANS D，COOL P，BAEYENS J，et al．Using mesoporous silica materials to immobilise biocatalysis-enzymes ［J］．Catal Commun，2005，6( 4) : 307－311．

［9］QIN W D．Silica nanoparticles as pseudostationary phase for protein separation ［J ］．Electrophoresis，2007，28 ( 17) : 3017－3023．

［10］KATIYAR A，PINTO N G．Visualization of size selective protein separations on spherical mesoporous silicates ［J］．Small，2006，2( 5) : 644－648．

［11 ］BARKLIS E，MCDERMOTT J，WILKENS S，et al．Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins ［J］．Embo J，1997，16( 6) : 1199－1213．

［12］PALACIO H J，MATHIEU C．A facile method for reversibly linking a recombinant protein to DNA ［J ］．Chembiochem，2009，10( 9) : 1551－1557．

［13］邹雪艳，董烁，李宾杰，等．纳米材料在蛋白质分离中的应用［J］．化学研究，2014，25( 5) : 544－550．

［14］SAMBROOK J，RUSSELL D W．Molecular cloning: a laboratory manual ［M］．New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001: 1252－1255．

［15］阮建兵，梅艳珍．多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用［J］．生物技术通报，2012( 6) : 49－53．［16］MERKENS H，SIELKER S，FETZNER K R．A new monocupin quercetinase of streptomyces sp．FLA: identification and heterologous expression of the qued gene and activity of the recombinant enzyme towards different flavonols ［J］．Arch Microbiol，2007，187( 6) : 475－487．

［17］杨玉东，徐菁华，杨林梅，等．金纳米棒表面修饰技术及其功能化的研究进展［J］．化工进展，2010，29 ( 3) : 389－396．

［18］谢海燕，甄蕊，王博，等．Ni2+-氮川三乙酸修饰的Fe3O4/Au核/壳纳米材料对组氨酸融合蛋白简便有效的分离［J］．分析化学，2009，A02: 13－13．

［19］牛瑞，秦胜利．蛋白质分离纯化技术研究进展［J］．化工科技市场，2010，33( 4) : 16－18．

［20］谢根生．等径纳米SiO2粉料的制备及其表征［J］．涂料工业，2006，36( 3) : 23－25．

［21］安悦，朱再明，胡皆汉，等．α，α'-二氧代烯酮环二硫代缩酮类化合物的特征红外光谱(Ⅲ) ［J］．光谱学与光谱分析，2001，21( 6) : 775－777．

［责任编辑:毛立群］

Construction of biofunctional hollow silica nanospheres for separating proteins

ZOU Xueyan1，HE Xiaofeng2，WANG Peng2，GUO Jingyu3，LIU Jin3*

( 1．Engineering Research Center for Nanomaterials，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China;

2．Minsheng College，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China;

3．College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China)

Abstract:Hollow SiO2-SH nanospheres were synthesized through the hytrodthermal method，then these microspheres were used to adsorb directly Ni2+ions to form SiO2-SH-Ni2+composite materials．In the end，the His-tagged fusion proteins can be separated from the mixture proteins by the SiO2-SH-Ni2+composite materials．The experimental results show that it is suitable for these prepared microspheres to separate the His-tagged proteins．

Keywords:hollow; silica; histidine; affinity separation

作者简介:邹雪艳( 1981―)，女，实验师，主要从事复合纳米材料的制备．*通讯联系人，E-mail: zouxy182838@ 163．com．

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 21271062)和河南省教育厅科学技术重点研究项目( 14B150003)．

收稿日期:2015－05－23．

中图分类号:TB34

文献标志码:A

文章编号:1008－1011( 2016) 01－0112－04