HPLC法同时测定定喘止咳糖浆中5种成分的含量

刘孝峰

嵊州市人民医院中药房，浙江 绍兴 312400



HPLC法同时测定定喘止咳糖浆中5种成分的含量

刘孝峰

嵊州市人民医院中药房，浙江 绍兴 312400

[摘要]目的建立高效液相色谱法同时测定定喘止咳糖浆中苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷和川陈皮素含量的方法。方法采用依利特C18柱，流动相为乙腈(A)-0.2%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：λ1=210 nm(苦杏仁苷)，λ2=254 nm(和厚朴酚、厚朴酚)，λ3=283 nm(橙皮苷、川陈皮素)。结果苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷、川陈皮素的线性范围分别为12.10～242.00 μg/mL(r=0.999 8)、7.65～153.00 μg/mL(r=0.999 3)、6.37～127.40 μg/mL(r=0.999 7)、4.29～85.80 μg/mL(r=0.999 9)、3.90～78.00 μg/mL(r=0.999 2)；5种成分的平均加样回收率(n=6)分别为98.62%、96.94%、99.17%、96.85%、97.84%，RSD分别为0.88%、1.12%、1.10%、1.04%、1.55%。结论定喘止咳糖浆中5种成分的含量测定方法准确、可靠。

[关键词]高效液相色谱法；定喘止咳糖浆；苦杏仁苷；和厚朴酚；厚朴酚；橙皮苷；川陈皮素

0引言

定喘止咳糖浆是由苦杏仁、厚朴、陈皮、麻黄、柴胡、紫苏叶、甘草7味中药组成的中药复方制剂，该制剂的功效为宣肺平喘、理气止咳，主要治疗风寒喘咳、胸腹胀满，也用于支气管哮喘、支气管炎等病症的治疗[1-2]，对预防流行性感冒有显著的临床疗效。原部颁的定喘止咳糖浆质量标准仅对处方中麻黄所含的盐酸麻黄碱进行了薄层定性鉴别，未对该方中相关组分进行定量研究，对该制剂的定量研究也未见报道，但仅1味药材定性并不能有效控制该制剂的质量和疗效，本研究对该制剂中苦杏仁、厚朴、陈皮3味药材中的5个成分(苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷、川陈皮素)进行定量方法学研究，为定喘止咳糖浆的全面质量控制提供科学依据。

1仪器与试药

1.1仪器安捷伦1200型HPLC色谱仪，G1315B可变波长检测器；VS-100UE型恒温超声波提取机(无锡沃信仪器有限公司)。十万分之一电子天平(Mettlertoledo XS205DU)。

1.2试药苦杏仁苷对照品(批号：110820-201305，含量以85.8%计)、和厚朴酚对照品(批号：110730-201313，含量以100%计)、厚朴酚对照品(批号：110729-200412，含量以100%计)、橙皮苷(批号：110721-201316，含量以95.3%计)均由中国食品药品检定研究院提供；川陈皮素(478-01-3，含量以98.0%计)购于上海纯优生物科技有限公司；定喘止咳糖浆(100 mL/瓶，批号：141012、141125、150109)购于河南禹州市药王制药有限公司；乙腈为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为重蒸馏水。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性实验色谱柱：依利特C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.2%冰醋酸溶液(B)，按表1进行梯度洗脱[3-9]；检测波长(0～29 min，λ1=210 nm[10-13]；29～50 min，λ2=254 nm[14-15]；50～70 min，λ3=283 nm[16-19])；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好，理论塔板数按川陈皮素计不得低于3 000，分离度均>2.0。

表1　流动相梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品储备液的制备分别称取苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷和川陈皮素对照品适量，分别加70%甲醇溶解并稀释，制成苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷、川陈皮素质量浓度分别为1.210、0.765、0.637、0.429、0.390 mg/mL的单一成分的对照品储备液。

2.2.2混合对照品溶液的制备分别吸取“2.2.1”项下各对照品储备液6.5、6.0、5.0、5.0、1.5 mL，用70%甲醇稀释，制成每1 mL含苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷、川陈皮素分别为157.3、91.8、63.7、42.9、11.7 μg的混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备精密量取定喘止咳糖浆4.0 mL，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液46 mL，并称定总重量，记录具体数据，采用超声波对样品进行超声处理20 min，取出后自然放至室温，称定，用70%甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.2.4阴性对照溶液的制备按照《中药成方制剂》第十三册定喘止咳糖浆质量标准中规定的处方工艺，分别制备苦杏仁空白样品、厚朴空白样品和陈皮空白样品。空白样品按照文中“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法，分别制备苦杏仁空白溶液、厚朴空白溶液和陈皮空白溶液。

2.3专属性实验分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液、苦杏仁空白溶液、厚朴空白溶液、陈皮空白溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图，按保留时间先后设置出峰顺序：苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷、川陈皮素，供试品溶液和混合对照品溶液所测各组分保留时间一致；苦杏仁空白溶液色谱图未见苦杏仁苷色谱吸收峰；厚朴空白溶液色谱图未见和厚朴酚、厚朴酚吸收峰，陈皮空白溶液色谱图未见橙皮苷、川陈皮素吸收峰，结果表明，处方中其他成分对所测成分无干扰。色谱图见图1～图5。

图1　对照品色谱图

图2　供试品色谱图

2.4线性关系考察分别精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分别置10 mL量瓶中，并用70%甲醇稀释成系列浓度的混合对照品溶液。按上述色谱条件测定，以峰面积A为纵坐标、对照品质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，结果见表2。

图3　苦杏仁空白溶液色谱图

图4　厚朴空白溶液色谱图

图5　陈皮空白溶液色谱图

组分回归方程线性范围(μg/mL)r苦杏仁苷A=1.0253×106C+512.412.10～242.000.9998和厚朴酚A=8.6134×105C+216.77.65～153.000.9993厚朴酚A=5.9735×105C-196.56.37～127.400.9997橙皮苷A=4.3384×105C+307.24.29～85.800.9999川陈皮素A=3.9672×105C-299.83.90～78.000.9992

2.5精密度试验精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液20 μL，按上述色谱条件测定，连续进样6次，记录5种成分的峰面积，计算各成分RSD：苦杏仁苷为0.83%，和厚朴酚为0.97%，厚朴酚为1.34%，橙皮苷为1.09%，川陈皮素为1.62%。

2.6重复性试验按样品含量测定方法对同一批号的6份样品进行测定，记录峰面积，计算RSD。结果显示，苦杏仁苷为0.38%，和厚朴酚为0.79%，厚朴酚为1.25%，橙皮苷为1.02%，川陈皮素为1.37%，表明重复性良好。

2.7溶液的稳定性试验取定喘止咳糖浆(批号：150109)的供试品溶液1份，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算各组分的RSD。苦杏仁苷的RSD为0.61%，和厚朴酚为0.94%，厚朴酚为1.27%，橙皮苷为0.82%，川陈皮素为1.84%，结果表明，24 h内供试品溶液具有良好的稳定性。

2.8加样回收率试验取6份已知含量的定喘止咳糖浆(苦杏仁苷为1.972 mg/mL，和厚朴酚为1.131 mg/mL，厚朴酚为0.804 mg/mL，橙皮苷为0.543 mg/mL，川陈皮素为0.149 mg/mL)适量，精密量取2.0 mL，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液25 mL、70%甲醇溶液25 mL，按“2.1”项下操作，取续滤液，过滤，作为加样供试品溶液。按上述色谱条件测定，计算各组分回收率。上述5个成分的平均加样回收率(n=6)分别为98.62%、96.94%、99.17%、96.85%、97.84%，RSD分别为0.88%、1.12%、1.10%、1.04%、1.55%。

2.9样品测定取3个批号的定喘止咳糖浆样品，照“2.2.3”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件测定苦杏仁苷、和厚朴酚、厚朴酚、橙皮苷和川陈皮素的含量，结果见表3。

表3　样品含量测定结果(mg/mL)

3讨论

3.1提取溶剂与提取方法通过对加热回流、不同时间(10、20、30 min)超声提取及不同浓度提取溶剂(40%甲醇、70%甲醇和甲醇)进行比较试验，确定供试品溶液制备的最佳条件：70%甲醇，超声提取20 min。

3.2流动相的选择笔者尝试应用甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%冰醋酸溶液进行试验，对比基线平稳和分离效果，最终确定以乙腈-0.2%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱。

3.3多指标的质量评价模式需要消耗大量对照品，对生产检验成本控制和实际质量监督评价存在一定影响，因此，该制剂能否采用一测多评法控制质量还有待进一步研究。

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Simultaneous determination of amygdalin,honokiol,magnolol,hesperidin and nobiletin in dingchuanzhike syrups by HPLCLIU Xiao-feng (Pharmacy of TCM,Shengzhou People′s Hospital,Shaoxing 312400,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for the simultaneous determination of 5 main components(amygdalin,honokiol,magnolol,hesperidin and nobiletin) in dingchuanzhike syrups.MethodsA stable HPLC method was established and the chromatography was accomplished on an Hypersil C18column,with a mobile phase of acetonitrile(A) and 0.2% glacial acetic acid solution(B) in a gradient elution.The flow rate was 0.8 mL/min.The column temperature was set at 30 ℃.Amygdalin was detected at 210 nm,honokiol and magnolol were detected at 254 nm,hesperidin and nobiletin were detected at 283 nm.ResultsAmygdalin,honokiol,magnolol,hesperidin and nobiletin had good linearity within 12.10～242.00 μg/mL(r=0.999 8),7.65～153.00 μg/mL(r=0.999 3),6.37～127.40 μg/mL(r=0.999 7),4.29～85.80 μg/mL(r=0.999 9),3.90～78.00 μg/mL(r=0.999 2)respectively.The average recovery rates and RSD were 98.62%(0.88%),96.94%(1.12%),99.17%(1.10%),96.85%(1.04%) and 97.84%(1.55%)respectively.ConclusionThe developed HPLC method is accurate and reliable.

Key words：HPLC;Dingchuanzhike syrups;Amygdalin;Honokiol;Magnolol;Hesperidin;Nobiletin

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602024

收稿日期：2015-06-16