复方青黛散的质量标准研究

马宏达，崔英宇，高　军，王琳琳，史国兵

沈阳军区总医院药剂科，沈阳 110016



·药学研究·

复方青黛散的质量标准研究

马宏达，崔英宇，高军，王琳琳，史国兵*

沈阳军区总医院药剂科，沈阳 110016

[摘要]目的建立复方青黛散的质量标准。方法采用TLC法对本制剂中青黛、牛黄、黄柏、甘草、冰片进行薄层鉴别。采用HPLC法对盐酸小檗碱进行含量测定：以Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(40∶60) (每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸钠)，流速为1.0 mL/min，检测波长为265 nm。结果薄层鉴别斑点清晰、分离较好，阴性对照无干扰；盐酸小檗碱在0.002～0.10 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 6)，平均加样回收率为100.31%，RSD=1.57% (n=6)。结论方法准确可靠、重现性好，能有效控制复方青黛散的质量，为提高复方青黛散的质量标准提供了依据。

[关键词]复方青黛散；质量标准；盐酸小檗碱；薄层色谱法；高效液相色谱法

0引言

复方青黛散由青黛、黄柏和甘草等九味中药组成，具有清热解毒、止痛消肿的功效。用于口腔炎、口腔溃疡。本方收载于《中国人民解放军药品制剂规范》中，目前该制剂质量标准不够完善，难以全面控制制剂质量。本研究旨在提高该制剂的质量标准，主要对黄柏、甘草、冰片、牛黄、青黛进行定性鉴别；以盐酸小檗碱为指标，采用HPLC法测定盐酸小檗碱的含量。结果显示，建立的方法可用于复方青黛散的质量控制，现报道如下。

1仪器与试剂

1.1仪器创新通恒LC3000型高效液相色谱仪(UV检测器)，岛津紫外可见分光光度计(UV-1700)，电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：BT125D]，数控超声锅提取器 (昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ3200DB)。

1.2试药与试剂复方青黛散(批号：20130805、20130909、20130927)自制，各药材阴性样品自制；盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201212)，靛蓝对照品(批号：110716-201111)，靛玉红对照品(批号：110717-200204)，猪去氧胆酸对照品(批号：100087-200610)，胆酸对照品(批号：100078-200414)，黄柏对照药材(批号：121510-201105)，甘草对照药材(批号：120904-201117)；冰片对照品(批号：110743-200905)，所有对照品和对照药材均由中国食品药品检定研究院提供。水为重蒸水(自制)，乙腈为色谱纯(购自Sigma公司)，磷酸(沈阳沈一精细化学品有限公司)，十二烷基磺酸钠(汕头市光华化学厂)。

2方法与结果

2.1TLC鉴别

2.1.1青黛的TLC鉴别[1-2]取复方青黛散0.5 g，加二氯甲烷5 mL，超声提取10 min，滤过，滤液作为供试品溶液。分别取靛蓝和靛玉红对照品适量，用少量的二氯甲烷将其溶解，得到混合对照品溶液(浓度均为1 mg/mL)。再取青黛阴性样品0.5 g，加二氯甲烷5 mL，超声提取10 min，滤过，滤液作为青黛阴性样品溶液。分别吸取上述溶液各5 μL，点于同一张含硅胶G薄层板上，同时以二氯甲烷-乙酸乙酯(10∶1)进行配制展开剂，将点好样品的薄层板放入带有展开剂的展开槽中展开，待样品完全展开后，取出，晾干。供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，有显相同颜色的斑点，且阴性样品不干扰青黛的薄层鉴别(图1)。此外，3批样品的供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，有相同颜色的斑点(图2)。

图1　青黛的薄层色谱鉴别(专属性)

图2　青黛的薄层色谱鉴别(重复性)

2.1.2牛黄的TLC鉴别[3]取复方青黛散1 g，加甲醇10 mL，超声提取15 min，滤过，蒸干滤液，用5 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。再分别精密称取胆酸、猪去氧胆酸对照品，用甲醇溶解，制成两者浓度均为1 mg/mL的对照品溶液。再取牛黄阴性样品1 g，加甲醇10 mL，超声提取15 min，滤过，蒸干滤液，用5 mL甲醇溶解，得到牛黄阴性样品溶液。分别吸取上述溶液各4 μL，点于同一张含硅胶G的薄层板上，同时以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸(10∶1∶1)配制展开剂，将点好的薄层板放入事先已放入展开剂的展开槽中展开，待完全展开后，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液的显色剂，将硅胶G板放于105 ℃下，直至薄层板斑点显色清晰为止。供试品的薄层色谱中，在与胆酸、猪去氧胆酸对照品薄层色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点(图3)。此外，3批样品的供试品薄层色谱中，在与胆酸、猪去氧胆酸对照品的薄层色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点(图4)。

图3　牛黄的薄层色谱鉴别(专属性)

图4　牛黄的薄层色谱鉴别(重复性)

2.1.3黄柏的TLC鉴别[4-5]取复方青黛散1.5 g，加入5 mL甲醇，超声处理15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1 g，加入5 mL甲醇，超声处理15 min，滤过，制成对照药材溶液。再精密称取盐酸小檗碱对照品，用甲醇将其溶解，制成浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液。再取黄柏阴性样品1.5 g，加入5 mL甲醇，超声处理15 min，滤过，得到黄柏阴性样品溶液。分别吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一张含硅胶G薄层板，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-冰醋酸(8∶1∶3∶1)的配比试剂为展开剂，将薄层板放入展开槽内展开，取出，晾干，并且将已跑完的薄层板放在紫外光灯(365 nm)下观察。供试品的薄层色谱中，在与黄柏对照药材的薄层色谱相应的位置上，显现相同颜色的荧光斑点；并且在与盐酸小檗碱对照品的薄层色谱相应位置上，显现相同颜色的荧光斑点，阴性对照样品不干扰黄柏的薄层鉴别(图5)。此外，3批样品的供试品薄层色谱中，在与黄柏对照药材薄层色谱相应的位置上，显现相同颜色的荧光斑点；并且在与盐酸小檗碱对照品的薄层色谱相应位置上，显现相同颜色的荧光斑点(图6)。

图5　黄柏的薄层色谱鉴别(专属性)

图6　黄柏的薄层色谱鉴别(重复性)

2.1.4甘草的TLC鉴别[6-7]取复方青黛散3 g，加60 mL石油醚(60～90 ℃)，进行加热回流提取，提取60 min，滤过，弃去滤液，在药渣中加入50 mL甲醇，再次进行加热回流提取60 min，滤过，得到滤液，把滤液蒸干，再用5 mL甲醇将残渣溶解，得到供试品溶液。另取甘草对照药材1 g，按照上述甘草供试品溶液制备方法进行操作，得到对照品药材溶液。再取甘草阴性样品3 g，加60 mL石油醚(60～90 ℃)，进行加热回流提取，提取60 min，将其滤过，弃去滤液，在药渣中加入50 mL甲醇，再次进行加热回流提取60 min，滤过，得到滤液，把滤液蒸干，再用5 mL甲醇将残渣溶解，得到甘草阴性样品。吸取上述溶液各2 μL，分别点在同一张含有硅胶G的薄层板上，展开剂配制成乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(16∶1∶1∶2)，展开，取出，自然晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，把显色后的薄层板放于105 ℃下，直至斑点显色清晰。供试品的薄层色谱中，在与甘草对照药材的薄层色谱相应位置上，显现相同颜色的斑点(图7)。此外，3批样品的供试品薄层色谱中，在与甘草对照药材的薄层色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点(图8)。

图7　甘草的薄层色谱鉴别(专属性)

图8　甘草的薄层色谱鉴别(重复性)

2.1.5冰片的TLC鉴别[8-9]取复方青黛散0.2 g，加入30 mL二氯甲烷，超声处理，提取30 min，滤过，得到供试品溶液。精密称取冰片对照品，加适量二氯甲烷超声使溶解，得到浓度为0.25 mg/mL的对照品溶液。再取冰片阴性样品0.2 g，加入30 mL二氯甲烷，超声处理，提取30 min，滤过，得到冰片阴性样品。分别吸取上述溶液各2 μL，点于同一张硅胶G薄层板上，配制成以环己烷-乙酸乙酯(5∶1)为展开剂，将薄层板放入展开缸中展开，展开后将其取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，将显色后的薄层板放于105 ℃下，加热直至斑点显现清楚。供试品薄层色谱中，在与冰片对照品薄层色谱相应位置上，显现相同颜色的斑点(图9)。此外，3批样品的供试品薄层色谱中，在与冰片对照品的薄层色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点(图10)。

图9　冰片的薄层色谱鉴别(专属性)

图10　冰片的薄层色谱鉴别(重复性)

2.2HPLC[10-11]

2.2.1色谱条件本实验选用C18色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸(40∶60) (每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸钠)为流动相；在265 nm条件下进行检测；以1 mL/min的流速进行试验。理论板数按盐酸小檗碱峰计算不低于3 000。

2.2.2溶液的制备①盐酸小檗碱对照品：取盐酸小檗碱对照品，精密称定，先用少量甲醇将其溶解，得到浓度为20 μg/mL的盐酸小檗碱对照品。②复方青黛散供试品：精密称取复方青黛散约0.1 g，将复方青黛散放在具塞锥形瓶中，再将50 mL甲醇加入锥形瓶中，密塞，称定重量，再进行超声提取，处理30 min，放冷，再称定其重量，用甲醇补足减失的重量，将其摇匀，滤过，得到复方青黛散供试品。③阴性对照样品溶液：取按处方除去黄柏的阴性样品0.1 g，按上述供试品溶液配制方法进行配制，得到阴性对照样品。

2.2.3专属性试验取黄柏阴性样品溶液、复方青黛散供试品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液，精密吸取各溶液20 μL，进行分析，结果见图11。

图11　盐酸小檗碱液相色谱图

结果显示，黄柏阴性对照不干扰黄柏中盐酸小檗碱的测定，且盐酸小檗碱与其他杂质的分离度均>1.5，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应均不低于3 000，表明此种方法的专属性很好。

2.2.4标准曲线的制备精密吸取20 μL浓度分别为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.10 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，注入HPLC，按照上述色谱条件进行分析，测定各自对照品的峰面积，进行线性回归，横坐标为盐酸小檗碱对照品的浓度(mg/mL)、纵坐标为峰面积值，得到回归方程：Y=2×107X-13 812，r=0.999 6。结果表明，盐酸小檗碱在0.002～0.10 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5精密度试验精密吸取20 μL盐酸小檗碱对照品(浓度为20 μg/mL)，按照上述色谱条件进行分析，将盐酸小檗碱对照品连续进样6次，记录6次色谱峰的峰面积，计算RSD，测得峰面积值的RSD为1.85% (n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性试验取复方青黛散样品约0.1 g，精密称定，按照“2.2.3”项下方法进行操作，分别在0、2、4、6、8、10 h测定各自样品中盐酸小檗碱峰面积，测得峰面积值的RSD为2.07% (n=6)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.2.7重复性试验精密称取复方青黛散样品约0.1 g(共6份)，按照“2.2.2”项下方法操作，测定每份复方青黛散样品中盐酸小檗碱的含量。结果显示，6份样品中盐酸小檗碱的平均含量为7.739 3 mg/g，RSD=1.31% (n=6)，结果表明，本方法重复性良好。

2.2.8加样回收率试验取复方青黛散样品约0.055 g (共6份)，精密称定，分别精密加入浓度为0.2 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液各2.2 mL(0.44 mg)，按“2.2.2”项下方法进行操作，求得盐酸小檗碱的回收率。结果显示，复方青黛散样品中盐酸小檗碱的平均回收率为100.31%，RSD=1.58% (n=6)，结果见表1。

表1　回收率试验

2.2.9样品含量测定取3个批号的复方青黛散，按照“2.2.2”项方法进行供试品溶液的配制，测得每份复方青黛散中指标性成分盐酸小檗碱的含量，结果见表2。

表2　三批样品含量测定结果

3讨论

3.1薄层鉴别本研究结果显示，各鉴别方法的专属性及重复性良好，Rf值在0.2～0.8范围内，且展开剂简单易行，可用于青黛、牛黄、黄柏、甘草、冰片的鉴别方法。

3.2含量测定本实验在供试品溶液制备中对提取方法(超声提取、回流提取)、提取溶剂(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、提取溶剂用量(30、50、70 mL)、提取时间(30、45、60 min)及提取次数(1、2、3次)进行了考察，最终确定上述最佳的供试品溶液制备方法，此法测得盐酸小檗碱的含量较高。

笔者选用乙腈-水(每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.34 g、磷酸二氢钠0.17 g，磷酸调pH值至3.0)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值至3.0)、乙腈-0.1%磷酸水溶液(每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸钠)等几种流动相进行预试验，同时对不同流动相的不同比例进行筛选，结果表明，乙腈-0.1%磷酸(40∶60) (每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸钠)为流动相时，盐酸小檗碱与其他成分完全分离，阴性对照不干扰盐酸小檗碱的含量测定，且峰形较好，结果可行，可用于复方青黛散的质量控制。

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Study on quality standard of compound qingdai powderMA Hong-da,CUI Ying-yu,GAO Jun,WANG Lin-lin,SHI Guo-bing*(Department of Pharmacy,General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish the quality standard of compound qingdai powder.MethodsTLC method was used for the qualitative identification of indigo naturalis,bovis calculus,phellodendri chinensis cort,glycyrrhizae radix et rhizoma,borneolum syntheticum.HPLC was used to determine the content of berberine hydrochloride.The determination was performed on Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) column with mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid water (40∶60) (SDS 0.05 g was added in 100 mL water) at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 265 nm.ResultsTLC spots were clear and well-separated without negative interference.The linear range of berberine hydrochloride was 0.002～0.10 mg/mL (r=0.999 6) with an average recovery of 100.31%,RSD=1.57% (n=6).ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible.It is effective in controlling the quality of compound qingdai powder and providing the basis to improve the quality standards.

Key words：Compound qingdai powder;Quality standards;Berberine hydrochloride;TLC;HPLC

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602022

*通信作者

基金项目：军队医疗机构制剂标准提高科研专项重点课题(13ZJZ02)

收稿日期：2015-07-15