不同方式诱导的大鼠骨质疏松模型的骨密度及骨代谢指标的差异

单梓梅

新疆维吾尔自治区人民医院,新疆 乌鲁木齐 830001

不同方式诱导的大鼠骨质疏松模型的骨密度及骨代谢指标的差异

单梓梅

新疆维吾尔自治区人民医院,新疆 乌鲁木齐 830001

目的：探讨维甲酸、D-半乳糖、苯妥英钠和糖皮质激素4种方式诱导大鼠骨质增生模型的骨密度和各项骨代谢生化指标的变化。方法：将50只大鼠随机分为对照组、维甲酸诱导模型组、D-半乳糖诱导模型组、苯妥英钠模型组和糖皮质激素模型组，每组10只大鼠。采用相应的方式诱导大鼠骨质增生，持续给药2个月后观察1个月。检测5组大鼠的骨密度、血钙、血磷、骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、甲状旁腺激素(PTH)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)等。结果：股骨骨密度、胫骨骨密度及BGP、IGF-1维甲酸诱导模型组、D-半乳糖诱导模型组、苯妥英钠模型组、糖皮质激素模型组均低于对照组(P＜0.05)。血钙及血磷D-半乳糖诱导模型组、苯妥英钠模型组、糖皮质激素模型组低于对照组(P＜0.05)；维甲酸诱导模型组高于对照组(P＜0.05)。ALP甲酸诱导模型组高于对照组(P＜0.05)、BGP、IGF-1维甲酸诱导模型组、D-半乳糖诱导模型组、苯妥英钠模型组、糖皮质激素模型组低于对照组(P＜0.05)。PTH、TRAP维甲酸诱导模型组、D-半乳糖诱导模型组、苯妥英钠模型组、糖皮质激素模型组均高于对照组(P＜0.05)。结论：维甲酸、D-半乳糖、苯妥英钠和糖皮质激素4种方式诱导的大鼠骨质疏松模型中，骨密度、BGP、IGF-1、PTH和TRAP表现出了相同的变化趋势，而血钙、血磷、ALP的变化趋势则因诱导方式不同而不同。

骨质疏松；大鼠；维甲酸；D-半乳糖；苯妥英钠；糖皮质激素

骨质疏松是一种以骨量低下、骨骼微结构组织破坏、骨脆性增加、骨折危险度增加为特征的代谢性疾病。骨质疏松症已经成为最常见的老年病之一，严重危害老年人的健康和生活质量［1］。目前全世界骨质疏松患者总人数约有两亿多人，是位居第六位的常见病、多发病。骨质疏松症的预防和治疗已经成为迫切需要解决的全球性问题。临床中要治疗骨质疏松症，对其发病机理的探索是必不可少的，而动物模型是最常用的研究手段［2］。动物模型的构建过程中，由于大鼠的骨改建周期短、生长快、易于饲养、成本低、稳定性和重复性好，所以成为最常见的骨质疏松实验动物模型。目前常用的大鼠骨质疏松模型的建立方法有以下几种：D-半乳糖致骨质疏松模型、去势模型、维甲酸干预模型、糖皮质激素干预模型、营养不良模型和废用模型。骨代谢生化指标是反映骨形成和吸收情况，并存在于血液和尿液中。骨矿物质相关的生化指标包括血钙、血磷、血镁、尿钙、尿磷［3］；骨形成相关生化指标有骨钙素(Bone Gla protein，BGP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)等［4］；骨吸收相关生化指标有抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)、甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)等［5］；新一代骨代谢血生化指标有护骨素(Osteoprotegerin，OPG)、瘦素(Leptin)、胰岛素生长因子-1 (Insulin-like growth factor-1，IGF-1)等［6］。检测骨代谢生化指标在骨病的诊断、评价、治疗中有非常重要的作用。本研究分别建立由维甲酸、D-半乳糖、苯妥英钠、糖皮质激素等诱导的骨质增生大鼠实验动物模型，并对4种骨质疏松大鼠模型骨密度及骨代谢生化指标进行了分析，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物 12周龄左右的SPF级SD雌性大鼠，体质量(300±20)g，购于兰州生物制品研究所有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(甘) 2012-002。

1.2 试剂 维甲酸、D-半乳糖、苯妥英钠、甲泼尼龙购于中国医药集团化学试剂有限公司；10%的水合氯醛购于兰州大学第二医院；大鼠血清骨钙素检测试剂盒购于上海研谨生物科技有限公司；大鼠甲状旁腺激素ELISA试剂盒购于上海信帆生物科技有限公司；大鼠血清TRAP检测试剂盒购于卡迈舒上海生物科技有限公司；Rat IGF-1 ELA试剂盒购于美国 Diagnostic Systems Laboratories公司，货号为DSL-10-2900。

1.3 仪器 双能X线骨密度仪(美国GE公司)；DX800型全自动生化分析仪(美国Beckman公司)；AL-204型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；M3多功能酶标仪(美国MD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨质疏松实验动物模型的建立 选取12周龄左右的SPF级SD雌性大鼠50只，体质量(300±20)g，观察1周，无死亡和精神异常后，随机分为5组，分别为对照组、维甲酸诱导模型组、D-半乳糖诱导模型、苯妥英钠模型组和糖皮质激素模型组，每组10只，在相同的条件下进行饲养。维甲酸诱导模型组大鼠每天相同时间段用维甲酸100 mg/(kg·d)灌胃，皮下注射2.5 mL生理盐水；D-半乳糖诱导模型组每天2.5 mL食用油灌胃，皮下注射D-半乳糖100 mg/(kg·d)；苯妥英钠模型组，每天60 mg/(kg·d)苯妥英钠悬浊液灌胃，皮下注射2.5 mL生理盐水；糖皮质激素模型组每天2.5 mL食用油灌胃，皮下注射3.5 mg/(kg·d)的甲泼尼龙；对照组每天用2.5 mL食用油灌胃，皮下注射2.5 mL生理盐水，持续上述给药方式2个月，给药结束后继续观察1个月，备用。

1.4.2 双能X线骨密度检测仪检测大鼠的骨密度 将5组大鼠分别取出，用10%水合氯醛按照3 mL/kg的剂量腹腔注射对大鼠进行麻醉，将大鼠俯卧位于扫描平台上，四肢外展，采用双能X线骨密度检测仪自带的小动物模式测定大鼠的右后肢股骨和胫骨的骨密度值。

1.4.3 大鼠的血钙、血磷和血清磷酸酶的检测 测完骨密度的大鼠，在麻醉状态下摘除大鼠眼球取血，分离血清并分装后于-20℃保存待用。用全自动生化分析仪测定血清中的血钙、血磷和血清磷酸酶水平。

1.4.4 ELISA法检测血清骨钙素的含量 在酶标包被板上设5个标准孔，浓度分别为1.2、0.8、0.4、0.2、0.1 μg/L，每个浓度加两个复孔。在酶标板待测样品孔中加样品稀释液40 μL，然后加待测大鼠血清10 μL，重复2个复孔。37℃孵育30分钟后洗5次拍干，每孔加50 μL酶标试剂。37℃孵育30分钟后洗5次拍干，每孔加显色剂A50 μL，显色剂B50 μL，37℃避光显色10分钟后，加100 μL终止液，酶标仪OD450读值。EXCEL作图计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为大鼠血清骨钙素的浓度。

1.4.5 大鼠血清甲状旁腺激素的检测 用标准品稀释液将标准品稀释为 10、5、4、2.5、1.25、0.625 U/mL，用样品稀释液将大鼠血清5倍稀释，取出试剂盒中已包被的ELISA板，分别加入标准品和样品，每孔50 μL，重复2个复孔。37℃孵育30分钟后洗5次拍干，每孔加入酶标试剂50 μL，37℃孵育30分钟后洗5次拍干，每孔先加入显色剂A50 μL，再加入显色剂B50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟，酶标仪OD450读值。EXCEL作图计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为大鼠血清甲状旁腺激素的浓度。

1.4.6 双抗体夹心酶联免疫吸附法检测大鼠血清中TRAP的含量 用标准品稀释液将标准品稀释为3.6、1.8、0.9、0.45、0.225 ng/mL，用样品稀释液将大鼠血清5倍稀释，将标准品和样品加入已经包被的ELISA板，每个浓度重复2个复孔，每孔加50 μL。37℃孵育30分钟后用洗涤液洗涤5次拍干，每孔加入酶标试剂50 μL，37℃孵育30分钟后用洗涤液洗涤5次拍干，每孔先加入显色剂A50 μL，再加入显色剂B50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟，加50 μ L终止液，酶标仪OD450读值。以标准物的浓度为横坐标，OD450为纵坐标，利用EXCEL绘制标准曲线，得出回归方程，将样品的OD450值带入回归方程，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶的浓度。

1.4.7 大鼠血清胰岛素样生长因子-1的检测

按照试剂盒的说明，确定标准管、样品管和空白管并做好标记，在标定的各孔分别加入50 μL的样品、标准品和控制品，接着在标定的各孔内分别加入100 μL的大鼠蛋白毒素抗体结合溶液，再加入100 μL的大鼠IGF-1抗毒血清，500～700 r/min，在摇床上室温摇动1小时，洗涤液洗涤5次后拍干，加入200 μL的Streptavidin-Enzymeconjugate溶液，500～700 r/min在摇床上室温摇动1小时，再洗涤5次后拍干，加入100 μL的TMB Chromogen溶液，500～700 r/min在摇床上室温摇动30分钟，避免阳光直射，加入100 μL的终止溶液，轻轻摇晃5～10秒，终止反应，酶标仪OD450读值并按照说明书计算结果。

1.5 统计学方法 采用Origin 8.0统计软件分析，计量资料采用表示，差异性通过t检验进行判断，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨密度及血钙、血磷 股骨、胫骨骨密度维甲酸及D-半乳糖诱导模型组，苯妥英钠、糖皮质激素模型组均低于对照组(P＜0.05)。血钙及血磷D-半乳糖诱导模型组，苯妥英钠、糖皮质激素模型组低于对照组(P＜0.05)，维甲酸诱导模型组高于对照组(P＜0.05)。见表1。

2.2 ALP、BGP、PTH、TRAP及IGF-1 ALP维甲酸诱导模型组高于对照组(P＜0.05)，D-半乳糖诱导模型组，苯妥英钠、糖皮质激素模型组低于对照组(P＜0.05)；BGP、IGF-1维甲酸、D-半乳糖诱导模型组，苯妥英钠、糖皮质激素模型组均低于对照组(P＜0.05)；PTH、TRAP维甲酸、D-半乳糖诱导模型组，苯妥英钠、糖皮质激素模型组均高于对照组(P＜0.05)。见表2。

表1 大鼠的右后肢股骨和胫骨的骨密度测量结果

表1 大鼠的右后肢股骨和胫骨的骨密度测量结果

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表2 各组ALP、BGP、PTH、TRAP及IGF-1比较

表2 各组ALP、BGP、PTH、TRAP及IGF-1比较

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3 讨论

反映新骨形成的生化指标包括血清碱性磷酸酶、骨碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型前胶原羟基端的前肽PICP等指标。本实验中反应新骨形成的生化指标测定了血清碱性磷酸酶和血清骨钙素，一般情况下，骨质疏松患者新骨形成减少，骨吸收升高，所以反映新骨形成的血清生化指标活性一般会降低。本研究中通过维甲酸诱导的骨质增生大鼠与对照组相比血清碱性磷酸酶活性显著上升，而其他3组的活性却显著下降。说明维甲酸诱导的骨质增生大鼠骨形成的活跃程度比较高，而其他3组大鼠的骨形成的活性比较低，其原因有以下2个方面：第一是由于维甲酸促进破骨而出现的骨形成代偿性增加。第二可能是骨形成和骨吸收都比较活跃，但骨吸收高于骨形成，表现出高转换型的骨代谢现象［7-8］。

BGP是一种维生素K依赖性的非胶原蛋白质，其生理作用尚不完全清楚，但已知与骨的矿化速率有关。经羟基化而成熟的骨钙素BGP由成骨细胞分泌后大部分沉积在骨基质中，小部分进入血液循环［9］，因此测定血中BGP一方面反映成骨细胞的活性，但更大程度上反映的是骨转换。本实验中4种方式诱导的骨质疏松模型组BGP较对照组显著减少，表明骨形成减少。

反映骨吸收的生化指标有尿羟脯氨酸、血浆抗酒石酸酸性磷酸酶、尿羟赖氨酸糖苷、尿胶原吡啶啉、Ⅰ型胶原羧基N末端肽、降钙素、甲状旁腺激素等。本实验中测定了血清甲状旁腺激素和血清抗酒石酸酸性磷酸酶，表明骨质疏松患者的骨吸收升高，造成骨量减少。实验结果显示4种方式诱导后大鼠血清甲状旁腺激素和血清抗酒石酸酸性磷酸酶的活性相比于对照组都升高了，说明骨质疏松患者骨吸收增强后打破了骨形成和骨吸收之间的动态平衡［10］。

IGF-1是包括成骨细胞在内的多种细胞的促有丝分裂剂，而且破骨细胞的增殖和分化也需要IGF-1的参与。IGF-1还可以通过不依赖促有丝分裂的途径促进骨基质的合成和矿化，它以自分泌和旁分泌的形式调节骨骼细胞的功能，影响骨代谢［11-12］。它能减少骨胶原退化，增加骨质沉淀，促进成骨细胞分化、成熟，刺激骨矿化，促进骨生长。本次实验中，与对照组相比，4种不同方式诱导的骨质疏松模型组的IGF-1明显降低，提示IGF-1的减少在骨质疏松的发生中起了一定的作用。

综上所述，维甲酸、D-半乳糖、苯妥英钠和糖皮质激素4种方式诱导的大鼠骨质疏松模型中，骨密度、BGP、IGF-1、PTH和TRAP表现出了相同的变化趋势，而血钙、血磷、ALP的变化趋势则因诱导方式不同而不同。

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Differences in Bone Mineral Density and Bone Metabolism of Rats Model with Osteoporosis Induced by Different Methods

SHAN Zimei
People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi 830001,China

Objective: To explore changes of the bone mineral density(BMD) and bone metabolism of rats model with osteoporosis induced by retinoic acid, D-galactose, phenytoin and glucocorticoids. Methods: All 50 rats were randomly divided into the control group, retinoic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group, each group ten rats. Rats model with osteoporosis was induced by the corresponding methods, given continuous administration two months and observed for one month. BMD, blood calcium, phosphorus, BGP, ALP, TRAP, PTH and IGF-1 of the rats in five groups were detected. Results: Femoral BMD, tibial BMD, BGP and IGF-1 in retinoic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were lower than these of the control group(P＜0.05). Blood calcium and phosphorus in D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were lower than these of the control group(P＜0.05); retinoic acid induced model group were higher than the control group(P＜0.05). ALP formic acid induced model group were higher than the control group(P＜0.05), retinoic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were lower than the control group in BGP and IGF-1(P＜0.05). PTH and TRAP of retinotic acid induced model group, D-galactose induced model group, phenytoin induced model group and glucocorticoids induced model group were higher than these of the control group(P＜0.05). Conclusion: In rats model with osteoporosis induced by retinoic acid, D-galactose, phenytoin and glucocorticoids, BMD, BGP, IGF-1, PTH and TRAP manifest the same change trend, while the change trends of blood calcium, phosphorus and ALP are different because of different induction methods.

osteoporosis; rats; retinoic acid; D-galactose; phenytoin; glucocorticoids

R285.5

A

1004-6852(2016)12-0023-04

2016-10-20

单梓梅(1972—)，女，硕士学位，副主任医师。研究方向：骨质疏松症的诊治。