牛血清白蛋白对人肝微粒体UGT2B7代谢齐多夫定的影响

汪洋 高洁 乔海灵(郑州大学医学院临床药理研究所 河南郑州 450052)



牛血清白蛋白对人肝微粒体UGT2B7代谢齐多夫定的影响

汪洋 高洁 乔海灵
(郑州大学医学院临床药理研究所 河南郑州 450052)

【摘要】目的 研究牛血清白蛋白对人肝微粒体尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridine-5'-diphosphate glucuronosyl-transferase,UGT)2B7代谢活性的影响｡方法 采用差速离心法制备人肝微粒体,以齐多夫定(3'-叠氮-3'-脱氧胸苷)为探针,考察人肝微粒体孵育体系中UGT2B7代谢活性,采用反相高效液相色谱法测定齐多夫定及其代谢物浓度｡孵育体系分为两组,分别为对照组和牛血清白蛋白组(含2%的牛血清白蛋白)｡结果 在两种人肝微粒体反应体系中,UGT2B7代谢齐多夫定的动力学行为均符合米曼式方程｡对照组和牛血清白蛋白组齐多夫定的酶动力学参数如下:Vmax分别为(1 359.0±135.8)和(1 268.4±300.1)pmol/(min·mg protein),Km分别为(368.0±64.3)和(111.4±6.9)μM,CLint分别为(3.7±0.4)和(11.4±2.7)μl/(min·mg protein)｡与对照组相比,牛血清白蛋白组的Km显著降低(P＜0.05),CLint明显升高(P＜0.05)｡结论 牛血清白蛋白可显著影响人肝微粒体反应体系UGT2B7催化活性,使UGT2B7代谢齐多夫定的Km降低､CLint升高｡

【关键词】牛血清白蛋白;人肝微粒体;尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶2B7;齐多夫定

人尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)是催化内源性和外源性物质葡萄糖醛酸化的膜结合酶｡葡萄糖醛酸结合反应是一种普遍的Ⅱ相代谢反应,在此反应中UGTs催化尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)与亲脂性底物结合,化合物的亲水性增加,促进其排泄,是机体重要的解毒途径之一｡人类迄今发现至少19种具有功能的UGTs,根据核苷酸序列的相似性分为4个家族:UGT1､UGT2､UGT3和UGT8[1],其中UGT1､UGT2在化学物质进行Ⅱ相生物转化时起主要作用｡UGT2B7系UGT2B家族重要成员,在肝脏中含量较为丰富｡UGT2B7不仅催化内源性化合物如雄甾酮､雌三醇､胆酸､类维生素A,也参与催化许多临床药物如非甾体抗炎药､麦考酚酸､齐多夫定､可待因､贝特类等,同时也是唯一催化吗啡类的Ⅱ相代谢酶[2]｡

体外代谢实验可有效排除体内诸多因素的干扰,有利于直接观察肝药酶对底物的选择性代谢,为进一步的整体实验提供可靠的理论依据｡人肝微粒体､人肝细胞､重组肝药酶等体外系统已成功用于体内肝脏药物代谢研究的预测｡目前,利用在人肝微粒体体系获得的酶动力学研究结果如酶动力学参数(如Km和Vmax)及抑制常数(Ki)等,预测体内的葡萄糖苷酸化程度也是比较常用的体外预测体内的方法之一｡但Lit-tle等[3]研究发现人肝微粒体中富含的亚麻酸和花生四烯酸等长链不饱和脂肪酸是UGT2B7的底物,在UGT2B7代谢其他底物时,脂肪酸可竞争性抑制UGT2B7的活性,导致体外预测的UGT2B7活性远远小于其体内的实际活性｡Rowland等[4]研究发现人肝微粒体反应体系中加入牛血清白蛋白,可减小脂肪酸的抑制作用,致UGT2B7 Km降低,CLint显著增加,从而提高体外实验预测的准确性｡经过一系列研究,Row-land提出“牛血清白蛋白效应"理论,即牛血清白蛋白可消除人肝微粒体反应体系中长链不饱和脂肪酸对UGTs的竞争性抑制作用,提高预测体内药物清除率的准确性｡目前国内尚无关于牛血清白蛋白对人肝微粒体中UGT2B7活性影响的报道｡

齐多夫定口服吸收良好,主要经肝脏中UGT2B7催化失活,生成齐多夫定葡萄糖苷酸｡齐多夫定是体内､体外研究UGT2B7活性公认的探针,可通过研究其在人肝微粒体孵育系统的固有清除率来推测人体内的清除率｡本研究国内首次考察了牛血清白蛋白对正常人肝微粒体UGT2B7代谢齐多夫定的影响,以期为准确预测体内药物代谢提供理论和实验依据｡

1 材料与方法

1.1 试验药物和试剂 牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司,批号1001116884,CAS 9048-46-8,纯度≥98%);尿苷二磷酸-α-D-葡萄糖醛酸(UDP-GA,三钠盐,Sigma公司,批号1001595481,CAS63700-19-6,纯度98%～100%);丙甲菌素(批号063M4008V,CAS27061-78-5,纯度≥98%);齐多夫定(3'-叠氮-3'-脱氧胸苷,厦门迈克制药有限公司,批号031102,纯度>99%);齐多夫定-β-D-葡萄糖苷酸(Toronto Research Chemicals Inc,批号A825050);磷酸二氢钾(天津市凯通化学试剂有限公司,分析纯,纯度≥99.5%);磷酸氢二钾(天津市风船化学试剂科技有限公司,分析纯,纯度≥99.0%);氯化镁(北京北伐精细化学品有限责任公司);高氯酸(天津市鑫源化工厂,纯度70.0%～72.0%);EDTA(湖南湘中地质实验研究所);甲醇(天津市四友精细化学品有限公司,批号433722-05126,色谱纯,纯度≥99.9%);乙腈(天津市四友精细化学品有限公司,批号432079-06517,色谱纯,纯度≥99.9%);异丙醇(天津市光复科技发展有限公司,分析纯,纯度≥99.7%);蔗糖(天津市风船化学试剂科技有限公司,分析纯);无水乙醇(天津市登科化学试剂有限公司,分析纯,纯度≥99.7%);磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯,纯度≥85.0%);盐酸(洛阳市化学试剂厂,分析纯,纯度36.0%～38.0%)｡实验用水均为超纯水｡

1.2 仪器 美国安捷伦HP1100高效液相色谱分析系统,二极管阵列检测器,自动进样器,美国安捷伦公司生产;6L-88B型旋涡混合器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;HH.W21.420型电子恒温水箱,北京市光明医疗仪器厂;贺利氏低温高速离心机(Kendro La-boratory Products);Milpore超纯水系统｡

1.3 治疗方法

1.3.1 人肝微粒体的制备与蛋白浓度的测定 收集肝血管瘤患者肝标本6例,年龄30～67岁,男性4例,女性2例,吸烟史､饮酒史患者均为2例,近期均未使用影响UGT酶活性的药物,肝功能均正常｡本试验方案经郑州大学医学伦理委员会批准,受试者签署知情同意书｡肝脏标本收集后立即用预冷的Tris-HCl缓冲液洗涤,滤纸将水分吸干,分装至冻存管中,液氮保存｡

采用差速离心法制备HLMs｡所用试剂和器材均于4℃预冷｡液氮保存的肝脏于冰上解冻,称重,加入相当于3倍肝脏重量的重悬液1(含0.15 M KCl,0.002 M EDTA),制备肝匀浆｡将肝匀浆置于离心管中,9 000 g离心20 min(4℃),取上清液｡将上清液100 000 g离心60 min(4℃)｡弃上清,加入Tris-HCl缓冲液(0.15 M,pH7.6)洗涤1次,100 000 g离心60 min(4℃)｡所得沉淀用磷酸盐缓冲液(含0.21 mol/L蔗糖,pH7.4)重悬,分装,-80℃保存待用｡Bradford法测定微粒体蛋白浓度｡

1.3.2 齐多夫定标准溶液的配制 精密称取0.267 2 g齐多夫定标准品于10 ml容量瓶中,用甲醇溶解,定容,得100 mM的齐多夫定标准液｡准确吸取5 ml该标准液至10 ml容量瓶中,用甲醇定容,得50 mM标准液｡分别依次用甲醇倍比稀释成浓度为25 000､12 500､6 250､3 125､1 560､780､390和195μM的齐多夫定标准溶液｡

1.3.3 孵育反应 两种孵育体系总体积均为100μl｡对照组:PBS(50μM,pH=7.4,0%牛血清白蛋白),微粒体蛋白(0.2 mg/ml),丙甲菌素(50μg/mg蛋白),蔗糖(0.25 M)｡牛血清白蛋白组:PBS(50μM,pH=7.4,2%牛血清白蛋白),其余组分相同｡事先加入系列浓度的齐多夫定标准液于氮气(室温)下吹干｡在37℃预孵育5 min,加入UDPGA(5 mM)启动反应,孵育时间为60 min｡

1.3.4 样品处理及色谱条件 样品处理孵育60 min后,冰浴加入高氯酸10μl终止反应,涡旋混匀30 s,离心10 min(12 000 rpm),取上清75μl,15μl进样｡色谱条件色谱柱:Diamonsil C18柱(5μm,250 mm× 4.6 mm,5μm);柱温:30℃;流动相为乙腈:磷酸钾缓冲液(20 mM,pH=2.2)=12∶88(v/v);流速:1.0 ml/min,二极管阵列检测器,波长266 nm;进样量15μl｡

1.3.5 人肝微粒体中齐多夫定葡萄糖苷酸标准曲线制备 取10 mg齐多夫定葡萄糖苷酸(95%),溶于1 ml超纯水中,得20 844.5μM的储备液｡依次倍比稀释,得一系列浓度的齐多夫定葡萄糖苷酸标准液:10 422.3､5 211.2､2 605.6､1 302.8､651.4､325.7､ 162.8､81.4､40.7､20.4和10.2μM｡

分别于孵育体系中加入系列浓度的齐多夫定葡萄糖苷酸对照品10μl(不加UDPGA),使其浓度分别为1.02､2.04､4.07､8.14､16.28､32.57､65.14和130.28μM,按照“1.3.4样品处理及色谱条件"项下步骤操作｡记录样品峰面积(A),样品峰面积对齐多夫定葡萄糖苷酸浓度(C)作回归曲线｡

1.3.6 酶活性的测定 以探针药物的转化程度(Turnover)作为酶活性指标,具体表示为TR [pmol/(min·mg)]=(△C×1000)/(B×T),其中△C为代谢产物齐多夫定葡糖苷酸浓度(μM),B为微粒体蛋白的浓度(mg/ml),T为孵育时间(min)｡

1.3.7 人肝微粒体孵育条件的优化 最适孵育时间的确定:体系加入UDPGA启动反应,分别于37℃孵育20､40､60､80､100和120 min,考察孵育时间对齐多夫定代谢的影响｡最适蛋白浓度的确定:于反应体系中加入不同蛋白浓度0.1､0.2､0.3､0.4､0.6和0.8 mg/m l,考察微粒体蛋白浓度对齐多夫定代谢的影响｡

1.3.8 人肝微粒体齐多夫定酶动力学参数的测定反应体系中底物齐多夫定的浓度分别为19.5､39.0､78.0､156.0､312.5､625.0和1 250.0μM,以代谢产物的生物转化程度(TR)为反应速度｡

1.4 统计学处理 采用Prism 5.0进行齐多夫定葡萄糖苷酸的酶动力学参数Km､Vmax和CLint的计算｡统计学分析均由SPSS 17.0软件包完成｡对照组与牛血清白蛋白组UGT2B7代谢的酶动力学参数采用配对t检验进行比较,P＜0.05为差异有统计学意义｡

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性 在本实验条件下,齐多夫定葡萄糖苷酸有较大的色谱峰,肝微粒体中的杂质､齐多夫定的色谱峰不干扰样品峰,在该色谱条件下,齐多夫定葡萄糖苷酸､齐多夫定的保留时间分别为8.2､20.2 min左右(见图1),说明该方法的专属性较高｡

图1 人肝微粒体中齐多夫定及其代谢物的高效液相色谱图

2.1.2 标准曲线 以齐多夫定葡萄糖苷酸样品峰面积对浓度作回归曲线,得方程为C=0.120 9A+0.080 7(r=1),表明齐多夫定葡萄糖苷酸在10.2～130.28μM范围内线性良好｡该方法的灵敏度为10.2μM｡

2.1.3 精密度和相对回收率 该方法的批间､批内RSD分别为1.10%～3.66%和1.07%～3.84%,均小于5%;齐多夫定葡萄糖苷酸的相对回收率为100.05%～103.15%(表1)｡结果表明,本实验方法的精密度和相对回收率均符合生物样品分析要求｡

2.1.4 人肝微粒体孵育时间和蛋白浓度的选择 考察齐多夫定葡萄糖苷酸生成量与孵育时间关系的结果显示,孵育时间为60 min时,齐多夫定葡萄糖苷酸生成量较大,因此选择孵育时间为60min(图2-A)｡考察齐多夫定葡萄糖苷酸的生成量与蛋白浓度关系的结果表明,蛋白浓度在0.1～0.8 mg/ml范围内齐多夫定葡萄糖苷酸生成的量与蛋白浓度基本呈线性｡综合实验条件,在保证检测灵敏度的情况下,本实验选择微粒体蛋白浓度为0.2 mg/ml(图2-B)｡

表1 精密度和相对回收率(n=5)

图2 人肝微粒体孵育时间(A)和蛋白浓度(B)对齐多夫定代谢的影响

2.2 牛血清白蛋白对UGT2B7代谢活性的影响 人肝微粒体反应体系中齐多夫定葡萄糖苷酸的酶动力学符合米曼氏方程,对照组和牛血清白蛋白组的酶动力学参数见表2｡与对照组相比,牛血清白蛋白组UGT2B7代谢齐多夫定的Km显著性降低(P＜0.05),CLint显著性升高(P＜0.05)｡结果表明,牛血清白蛋白显著影响人肝微粒体中UGT2B7的催化活性｡

表2 人肝微粒体中齐多夫定葡萄糖苷酸药动学参数(n=6)

3 讨论

药物在人体内肝脏代谢清除率的体外预测已经日趋成熟,可通过体外研究数据估算药物体内的代谢清除率｡目前,人源性肝细胞和肝微粒体的可获得性,人肝细胞由新鲜制备到冷冻保存,使人体内药物肝脏代谢清除率体外预测的准确性得到很大改善｡但药物代谢清除率的预测还存在一些问题｡Lwatsubo等[5]对25种不同化合物的体内外清除率进行比较,发现50%的预测值与实测值相比误差在3倍范围之内,而70%的结果在5倍误差范围之内｡

Uchaipichat等[6]体外研究发现,药物葡萄糖苷酸化过程获得的酶动力学参数(如Km和Vmax)及抑制常数(Ki)也常常低估体内的葡萄糖苷酸化程度｡肝微粒体中的亚麻酸､亚油酸和花生四烯酸等长链不饱和脂肪酸可被UGT2B7催化代谢生成其葡萄糖苷酸化产物｡当UGT2B7催化代谢其他化合物时,长链不饱和脂肪酸会竞争性抑制UGT2B7的活性｡Nenad等[7]采用UGT2B7重组酶和混合人肝微粒体研究发现,牛血清白蛋白可影响UGT2B7的催化活性｡Miners等[8-9]报道体外反应体系中的牛血清白蛋白可使UGT2B7的活性明显增强,加入牛血清白蛋白,Km约降低了一个数量级,显著提高了预测的准确性｡因此研究经UGT2B7代谢的药物时,人肝微粒体中加入牛血清白蛋白可消除长链不饱和脂肪酸对UGT2B7的抑制作用,提高体外代谢实验预测体内药物清除率的准确性｡

Michael等[10]研究证实,齐多夫定比吗啡､可待因更适合作为UGT2B7的特异性探针｡齐多夫定是一种有效的核苷类逆转录酶抑制剂,可有效抑制病毒复制,降低艾滋病的传染性,重建患者的免疫功能,其在体内经UGT2B7催化生成齐多夫定葡萄糖苷酸｡本研究以齐多夫定为探针,在国内首次报道了牛血清白蛋白对人肝微粒体中UGT2B7代谢活性的影响｡研究发现微粒体反应体系中加入2%的牛血清白蛋白后,UGT2B7代谢齐多夫定的酶动力学参数发生改变,Km明显降低(P＜0.05),CLint显著升高(P＜0.05)｡证实牛血清白蛋白消除了反应体系中固有存在的抑制剂对UGT2B7的抑制作用,进而增强了其代谢活性｡因此研究UGTs参与代谢的药物,尤其是UGT2B7参与代谢的药物,进行人肝微粒体代谢实验应加入一定量的牛血清白蛋白,使实验结果尽可能准确地反映体内药物代谢过程｡

本研究还在国内首次建立了人肝微粒体中齐多夫定葡萄糖苷酸的高效液相测定方法｡齐多夫定在266 nm处存在最大吸收峰,在此波长条件下,齐多夫定葡萄糖苷酸也存在很强的吸收,且孵育体系中的其他物质不干扰样品峰,最终确定检测波长为266 nm｡曾尝试采用甲醇-水作为流动相,在此条件下,虽然齐多夫定峰形良好,但齐多夫定葡萄糖苷酸的色谱峰拖尾非常严重｡因此考察了乙腈-磷酸盐缓冲液(20 mM, pH=2.2)流动相及不同比例对分离效果的影响,发现乙腈-磷酸盐缓冲液比例为12∶88时两种物质的分离度和柱效均比较理想,故加以选用｡实验结果证明,本研究建立的人肝微粒体中齐多夫定葡萄糖苷酸的高效液相色谱测定方法,操作简便､灵敏度高､重现性好､专属性强,为UGT2B7的体外活性测定奠定了基础｡

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Effects of bovine serum album in on zidovudine glucuronidated by UGT2B7 in human liver m icrosomes

Wang Yang,Gao Jie,Qiao Hailing
(Department of Clinical Pharmacology,School of Medicine,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China)

【Abstract】Objective To investigate the efect of bovine serum albumin(BSA)on the activities of UDP-glucuronosyltrans-ferase(UGT)2B7 in human livermicrosomes(HLMs).M ethods HLMswere prepared by diferential centrifugationmethods.The kinetics of glucuronidation of zidovudine(AZT,3'-azido-3'-deoxy-thymidine),a selective UGT2B7 substrate,was measured to reflect the activity of UGT2B7 in HLMs.The formations of AZT and itsmetabolite,AZT-β-D-glucuronide,were analyzed using a reversed-phase high-performance liquid chromatography.Incubation systems were divided into two groups.One was control group and the other was BSA group which included 2%BSA.Results UGT2B7-dependent AZT glucuronida-tion in control and BSA groups showed that the results were consistent with a typical Michaelis-Menten equation.The enzyme kinetics parameters of AZT in controland BSA groupswere as folows:the Vmaxwere(1 359.0±135.8)and(1 268.4±300.1)pmol/(min·mg protein),the Kmwere(368.0±64.3)and(111.4±6.9)μM,the CLintwere(3.7±0.4)and(11.4± 2.7)μl/(min·mg protein),respectively.Compared with control group,the Kmvalue of UGT2B7 was significantly decreased and the CLintvalue was significantly increased in the BSA group (P＜0.05).Conclusion The activity of UGT2B7 in HLMs wasbook=11,ebook=17significantly influenced by BSA which decreased the value of Kmand increased the value of CLint.

【Key words】bovine serum albumin;Human livermicrosomes;UGT2B7;zidovudine

(收稿日期:2015-09-01)

通讯作者:乔海灵,E-mail:qiaohl@zzu.edu.cn｡

【中图分类号】R 96

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.01.002