虎杖提取物对去卵巢小鼠下生殖道类雌激素样作用研究

喻 佳，陈银芳，王金钱，王少军(.江西省南昌市中西医结合医院，南昌0006；2.江西中医药大学，南昌0006；.中国中医科学院中药研究所，北京00700)



虎杖提取物对去卵巢小鼠下生殖道类雌激素样作用研究

喻 佳1，陈银芳2*，王金钱3，王少军3(1.江西省南昌市中西医结合医院，南昌330006；2.江西中医药大学，南昌330006；3.中国中医科学院中药研究所，北京100700)

摘要：目的研究虎杖提取物对去卵巢小鼠下生殖道的类雌激素样作用。方法昆明种小鼠40只，体质量22～26 g，清洁度II级，其中30只小鼠进行动物造模后，将合格鼠随机分为3组：虎杖提取物组(Em)、乙烯雌酚组(E2)和对照组即空白基质组，另外10只小鼠不造模设为正常组。Em组和E2组，根据各鼠实际体质量精密称取虎杖提取物和乙烯雌酚，用眼科小镊子或微量加样器分别将药物注入实验鼠阴道深处，对照组同法给予相应量的空白基质栓，连续7 d，于给药后5，6和7 d及最后1次给药后24~48 h各作l～2次阴道涂片检查，观测小鼠阴道角化细胞阳性率、乳酸杆菌菌群变化、pH值变化及阴道黏膜组织病理学分级，以此4个指标来研究虎杖提取物对去卵巢小鼠下生殖道类雌激素样作用。结果虎杖提取物对去卵巢小鼠下生殖道有一定的类雌激素样作用，与对照药一样能显著提高阴道角化细胞阳性率，显著增加阴道乳酸杆菌菌群数，恢复阴道酸性环境，改善阴道局部炎症的病理变化。结论虎杖提取物具有类雌激素样活性，有进一步研发的价值。

关键词：白藜芦醇；老年性阴道炎；虎杖植物雌激素

老年性阴道炎是绝经后妇女的高发性疾病，其发病率国内报道为30%~58.6%，国外报道高达98.5%[1]。其主要症状表现为阴道干涩、刺激感、阴道分泌物稀薄、呈淡黄色，严重者有血样白带、外阴瘙痒、阴道烧灼感；性交后出血、下坠感或伴有尿频、尿急等泌尿道感染症状，严重影响老年患者的身心健康。本病由卵巢功能衰退、体内雌激素水平下降所致，中医总的病机为肾气虚弱，湿浊内乘。近年来，临床研究资料显示，雌激素替代疗法在治疗围绝经期综合征疾病中不良反应明显，费用昂贵，且长期使用可增加子宫癌及乳腺癌的发病率。而植物雌激素作为一种天然化合物，不良反应小，对生殖、骨骼、心血管等系统具有广泛作用，备受人们关注。

天然白藜芦醇作为植物雌激素，主要以虎杖苷的形式存在于虎杖的根和根茎中。本实验以虎杖根粗提物对去卵巢小鼠下生殖道进行类雌激素样作用研究，旨在为虎杖在临床上用于治疗及预防老年性阴道炎及雌激素缺乏的相关疾病提供实验依据。

1仪器与材料

1.1仪器HH-4数显恒温水浴锅，江苏城西晓阳电子仪器厂；DFY-500克摇摆式高速中药粉碎机，温岭市大德中药机械有限公司；SHZ-III型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；旋转蒸发器(R-201)、生物显微镜，上海生申科技有限公司；低温冰箱，海尔电器；叮-II菌物培养箱，上海一恒科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；ZT-12P生物组织自动脱水机、YB-6D生物组织石蜡包埋机，湖北孝感市亚光医用电子公司。

1.2试药虎杖，湖北毫州市永刚饮片厂；空白基质

栓，江西中医学院药理实验室；乙烯雌酚，合肥久联制药有限公司；苏木精、蛋白胨、肉膏，上海化学试剂采购供应站试剂厂；伊红、pH试纸，上海试剂三厂。

1.3动物健康、性成熟的清洁级雌性未孕小鼠40只，购自江西中医学院实验动物中心(JXZY(赣)2008-9)，质量22～26 g，喂养在江西中医学院现代中药研究国家重点实验室(实验动物使用许可证号：JXXK(赣)2008-0024)。

2实验方法

2.1实验药物的提取和配制

2.1.1 虎杖提取物制备 取虎杖原料200 g,粉碎成粗粉，过40目筛，精确称取10 g粉末， 置于圆底烧瓶中，加体积分数为80%的乙醇120 mL，置于水浴锅上回流抽提2 h，水浴锅温度70 ℃，将提取物抽滤，得滤液Ⅰ待用；再重复提取1次，得滤液Ⅱ，合并2次滤液即为提取物。水浴低温回收乙醇，将提取物置于56 ℃水浴锅上蒸发至无醇味，减压浓缩后得褐色浸膏，为虎杖提取物，待用。

2.1.2 乙烯雌酚制剂的配制 取2 mg药片，充分研细，用20 mL 2 g·L-1的吐温-80溶解，备用。

2.2 动物模型建立

2.2.1 动物模型 乙醚棉球吸入麻醉后，将小鼠腹位固定。在小鼠最末肋骨下、腋中线和距脊柱外侧约2 cm交叉处剪除长毛，切开皮肤和背肌，有乳白色发亮的脂肪团，其中包埋着卵巢。用小镊子轻夹脂肪团，拉出切口外，分离脂肪，即见粉红色、黄红色的卵巢。取一丝线将卵巢下输卵管及脂肪一并结扎。剪下卵巢，将子宫角送回腹腔，然后摘取对侧卵巢，缝合皮肤。在去卵巢后的第5~8日逐只进行阴道涂片，每日1次，连续5~10 d，选取连续5 d呈现间情期(镜下见大量多核白细胞，少量上皮细胞，无角化细胞)的小鼠为合格鼠[2]。

2.2.2 分组及给药方法 将合格鼠随机分为3组，虎杖提取物组(Em)、乙烯雌酚组(E2)和对照组，每组各10只小鼠，另设一组未做处理的成年小鼠，称为正常组。虎杖提取物(60 mg·kg-1)、乙烯雌酚(0.06 mg·kg-1)和空白基质栓，Em组和对照组用眼科小镊子、E2组用微量加样器分别将药物送入实验鼠阴道深处，每组每只鼠每天给药1次，连续7 d，于给药后5，6和7 d及最后1次给药后24与48 h各做l~2次阴道涂片检查.

2.3 各项观察指标的方法学

2.3.1 阴道涂片检查方法 用左手背位固定小鼠，右手持吸管，其内预先吸有生理盐水0.1~0.2 mL，轻轻插入小鼠阴道2~3 mm，抽吸2~3次，滴1滴吸液置于载玻片上，HE染色，树胶封片，再置于显微镜下进行细胞学检查。 评判标准：角化细胞占脱落细胞比例>50%为阳性反应。

2.3.2 阴道分泌物乳酸杆菌培养法[3]用微量加样器取100 μL生理盐水，反复冲洗小鼠阴道8次，取60 μL的阴道冲洗液10倍系列稀释至10-6，用微量加样器接种于MRS选择性培养基上，经37 ℃、48 h培养后进行活菌计数(cfu·mL-1)。

2.3.3 阴道pH值测定 精密pH试纸，保存干燥，检查时右手戴一次性塑料手套，取pH试纸直接贴附于阴道侧后壁，贴壁5 s，待变色后在自然光下读取pH值。pH值评判标准：在无阴道感染的条件下，阴道pH值为3.5~4.5；细菌性阴道病时，阴道pH值>4.5；阴道pH值为5.0~6.0时，提示患者处于阴道感染或血清雌激素水平降低；阴道pH值为6.0~7.5时，提示阴道处于绝经期。

2.3.4 阴道黏膜组织病理学分级 标本获取：采用颈椎脱臼法处死小鼠，剖取阴道标本进行病理组织学观察。按照小鼠阴道黏膜组织病理学分级，分为0~Ⅲ级，0级为黏膜上皮光滑，无坏死脱落，黏膜下无充血、水肿、出血、炎细胞浸润，阴道内无炎性渗出物；Ⅰ级为黏膜上皮无坏死脱落，黏膜下充血、水肿，阴道内无炎性渗出物;Ⅱ级为黏膜上皮有灶性坏死脱落，黏膜下充血、水肿、点状出血、少量炎细胞浸润，阴道内有少量炎性渗出物；Ⅲ级为黏膜上皮坏死脱落，黏膜下充血、水肿、片状出血、炎细胞浸润，阴道内有大量炎性渗出物。0~Ⅰ 级属正常阴道黏膜病理检查结果；Ⅱ~Ⅲ级为异常阴道黏膜病理改变，提示阴道炎症[4]。

3 实验结果

所测得各组资料及统计结果见表1～5。

表13组小鼠阴道黏膜角化细胞阳性反应率比较

Tab.1 Comparison of positive reaction rate of three groups mice vaginal mucosa keratinocytes

药物剂量/mg·kg-1动物数/只阳性动物数/只阳性反应率/%E20．061010100Em60．00109090＊＊对照组—1000正常组1010100

注： Em与E2组比较P=0.86，P>0.05；**Em与对照组比较P=0.008，P<0.01；Em与正常组比较P=0.86，P>0.05。

表2 角化细胞占阴道脱落细胞的比例

Tab.2 Keratinocytes specific scale of vaginal exfoliated cells

组别动物数/只角化细胞占脱落细胞比例/%E21072．51±2．74Em1069．00±6．86＊＊对照组100．00±0．00正常组1070．25±2．98

注： Em与E2组比较P>0.05；Em与对照组比较**P<0.01；Em与正常组比较P>0.05。

表3 阴道分泌物乳酸杆菌检测比较

Tab.3 Comparison of vaginalLactobacillustest

组别动物数/只乳酸杆菌活菌数/105cfu·mL-1E2104．90±1．19Em104．50±1．35＊＊对照组100．90±0．56正常组104．60±1．28

注： Em与E2组比较P>0.05；Em与对照组比较**P<0.01；Em与正常组比较P>0.05。

表4用药前、后阴道pH值变化

Tab.4 Vaginal pH change before and after the medication

组别动物数用药前动物数/只用药后动物数/只/只6．0～7．53．0～4．55．0～6．06．5～7．5E210101000Em1010910*对照组1010028正常组1010910

注： 阴道正常pH值<4.5。用药前,4组pH值都在6.0~7.5之间，P>0．05；用药后，Em与E2组比较P>0.05；Em与对照组比较**P<0.05；Em与正常组比较P>0.05。

表5去卵巢小鼠阴道黏膜病理分级

Tab.5Pathological classification of ovarian mouse vaginal mucosa

组别动物数/只病理分级后动物数/只0级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级E2108200Em106310*对照组100064正常组1073

注： Em与E2组比较P>0.05； Em与对照组比较**P<0.05；Em与正常组比较P>0.05。

4 结论

阴道角化细胞>50%为阳性反应：Em组有9只小鼠达标(90%)，E2组及Em组的10只小鼠全部达标(100%)，对照组无小鼠达标(0)，Em组明显高于对照组，二者比较有极显著性差异(*P<0.01)，Em组与E2组比较无显著性差异(P>0.05)，见表1；角化细胞占阴道脱落细胞比值比较，Em组与E2组比较，无显著性差异(P>0.05)，Em与对照组比较，有极显著性差异(*P<0.01)，见表2。

阴道分泌物乳酸杆菌计数比较：Em组乳杆菌数明显多于对照组，有极显著性差异(*P<0.01)；Em组与E2组比较，无显著性差异(P>0.05)。见表3。

造模后小鼠阴道pH值检测：3组都在6.0~7.5之间，无显著性差异；用药后3组小鼠比较：pH值为3.0~4.5，Em组与E2组、正常组比较，无显著性差异(P>0.05)，Em组与对照组比较，有显著性差异(*P<0．05)，见表4。

用药后小鼠阴道黏膜病理分级：Em与E2组、正常组比较无显著性差异(P>0．05)，Em与对照组比较，有显著性差异(*P<0.05)，见表5。

不良反应：3组用药过程中均未出现不良反应。

5 讨论

虎杖中的二苯乙烯类化合物白黎芦醇被证实是其主要雌激素活性成分。它能与17β-雌二醇竞争，结合于雌激素受体，并激活雌激素应答基因的转录。Bertelli等研究表明，每天4杯葡萄酒能有效增加绝经女性的骨密度，该作用与白藜芦醇能激活碱性磷酸酶(骨矿化的关键酶)有关，还可能与具有雌激素样作用的白藜芦醇抑制骨吸收有关。白黎芦醇的分子结构类似于雌激素受体-α的拮抗剂——二乙基己烯雌酚，其作用方式和作用强度与己烯雌酚或雌二醇等传统雌激素相同。除此之外，白藜芦醇还具有雌激素调节作用，在缺乏E2的条件下，其对乳癌细胞起雌激素与拮抗剂的双重作用。

另外，虎杖中的蒽醌类化合物、大黄素和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等成分都被证实也具有雌激素活性。宋静荣[5]的研究表明，虎杖提取物能显著增加去卵巢大鼠阴道和子宫质量、改善子宫萎缩状况、增加去卵巢大鼠血清雌二醇含量和降低促黄体生成素含量。这对于调节绝经后的内分泌以及改善与促黄体生成素有关的绝经期潮热症状具有重要的意义。Matsuda等[6]研究发现， 中药虎杖提取物中的大黄素和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷显示了雌激素活性，可促进人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖。

中国地大物博，中草药种类繁多，虎杖虽被证实是含白藜芦醇成分最高的中药，但从目前可以参考的文献来看，国内还没有对虎杖进行阴道雌激素活性的动物实验研究，故本课题用虎杖提取物对去卵巢小鼠下生殖道类雌激素样作用做实验研究，局部给药,以阴道角化细胞阳性率、阴道乳酸杆菌数、阴道pH值和阴道病理组织分级作为观察指标，结果显示， 虎杖提取物具有很强的雌激素活性，本实验为中药虎杖在预防和治疗老年性阴道炎或雌激素相关疾病方面提供实验依据，为这种价格低廉、取材广泛的植物能够得到更好的开发和利用提供实验依据。

参考文献：

[1]刘敏如，谭万信．中医妇产科学[M].北京：人民卫生出版社出版，2001：921.

[2]Bertelli A A,Giovannini L,Stradi R,et al.Kinetics of trans-and cis-resveratrol (3， 4′， 5-trihydroxystilbene)after red wine oral administration in rats[J].Int J Clin Pharmacol Res, 1996,16:77-81.

[3]王世祥，井文寅，车锡平，等.怀牛藤总皂甙抗生育作用及其机理[J].西北药学杂志， 1997,12(5)：209-211.

[4]卢健,吴琳,张恩户,等.花仙宫血胶囊对雌性大鼠动情周期及生殖内分泌的影响[J].西北药学杂志,2013，28(2)：159-160.

[5]宋静荣.虎杖提取物对去势大鼠雌激素的影响[J].中国妇幼保健，2008，23(28)：4029-4030.

[6]Hisashi Matsuda,Hiroshi Shimoda,Toshio morikawa, et al. Phytoestrogens from the roots ofPolygonumcuspidatum(Polygonaceae):Structure-requirement of hydroxyanthraquinones for estrogenic activity[J]. Bioorg Med Chem Lett，2001,11(14):1839-1842.

Study on the estrogen-like effect ofPolygonicuspidatisextracts on the lower genital tract of ovariectomized mice

YU Jia1,CHEN Yinfang2*,WANG Jinqian3,WANG Shaojun3(1. Integrative Medicine Hospital of Nanchang Jiangxi, Nanchang 330006, China;2. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006, China;3. Institute of Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing100700, China)

Abstract:ObjectiveTo study on the hornlogous estrogen effect of Polygoni cuspidatis extracts on the lower genital tract of ovariectomized mice. Method40 Kunming mice (Cleanness class II) weighting 22-26 g were used, in which 30 Kunming mice were ovariectomized and randomly divided into the following 3 groups: the control group, Polygoni cuspidatis extracts treatment group (Em), and diaethylstilbestroli treatment group (E2) .The rest 10 Kunming mice were not ovariectomized and used as normal group. Each group was treated with the vaginal suppository carrying Polygoni cuspidatis extracts (60 mg·kg-1·d-1), or diaethyls stilbestroli (0.06 mg·kg-1·d-1) .Within 7 days, vaginal smear examination was performed for 1-2 times on the 5th, 6th, 7th day after the treatment as well as 24-48 hours after the final medicine administration. The observing index was as follows: the positive rate of the vaginal diversification cells, the variation of lactobacillusflora, the variation of pH value and the pathological grade of vaginal mucosa.ResultsThe Polygoni cuspidatis extracts simulated the estrogen effects on the lower genital tract of ovariectomized mice with a significant improvement of the positive rate of vaginal diversification cells. Polygoni cuspidatis extracts significantly increased the number of lactobacillusfloras, recovered the acidic environment of vagina, and improved the pathological changes of local inflammation in the vagina. Conclusion This is the first report about the estrogen functions of Polygoni cuspidatis extracts on the lower genital tract in ovariectomized mice, providing the potential value for further research and development in menopause-related diseases.

Key words:resveratrol; Polygoni cuspidatis for senile vaginitis; phyto-oestrogens

(收稿日期：2015-06-24)

*通信作者：陈银芳，女，讲师

作者简介：喻佳,女，主治医师

中图分类号：R965

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)02-0164-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.016