兰花颗粒质量标准研究

康玉霞，雷　丸，王　莹，郭飞燕，王晓娟*(1.陕西中医药大学药学院，咸阳　71046；.军事口腔医学国家重点实验室，第四军医大学口腔医院药剂科，西安　71003)



兰花颗粒质量标准研究

康玉霞1，2，雷丸2，王莹2，郭飞燕2，王晓娟2*(1.陕西中医药大学药学院，咸阳712046；2.军事口腔医学国家重点实验室，第四军医大学口腔医院药剂科，西安710032)

摘要：目的建立兰花颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱法(TLC)鉴别本制剂中的板蓝根、大青叶和忍冬藤；采用高效液相色谱法(HPLC)测定制剂中(R，S)-告依春的含量，色谱柱为Spursil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(7∶93)；检测波长为245 nm。结果在选定的薄层色谱条件下，斑点显色清晰，分离效果良好。(R，S)-告依春质量浓度在0.30~2.12 μg·mL-1内呈良好的线性关系(r=0.999 7)；平均回收率为87.5%，RSD为1.0%(n=9)。结论该方法专属性强、重复性好、简便可行，可用于兰花颗粒的质量控制。

关键词：兰花颗粒；(R，S)-告依春；薄层色谱；高效液相色谱;

疱疹性口炎病原体为Ⅰ型疱疹病毒引起的急性口腔黏膜炎症[1]，婴幼儿感染多为原发性，无明显季节性，一年四季散发[2]。研究发现疱疹病毒集中于完整疱疹液内，溃破后引发感染症状，使得疼痛严重[3]。兰花颗粒是由第四军医大学口腔医院研制的中药复方制剂，主要由板蓝根、大青叶、忍冬藤等五味中药组成，具有清热解毒、解表通便之功效，主治疱疹性口炎、病毒性上呼吸道感染、四时感冒等症。板蓝根具有清热解毒、凉血利咽[4]、调节和保护机体免疫力的作用[5]。大青叶具有清热解毒、利咽止痛[6]、抑制病原微生物和提高机体免疫力的作用[7]。为有效控制药品质量、保证药品疗效，笔者对兰花颗粒的质量标准进行研究，采用薄层色谱法对板蓝根、大青叶和忍冬藤进行鉴别，并采用高效液相色谱法对板蓝根中的主要药效成分(R，S)-告依春进行含量测定，建立可控制该制剂质量的标准。

1仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(LC-20AT，日本岛津公司)；KQ5200E型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；十万分之一电子天平(BT125D，德国赛多利斯公司)；离心机(LD5-10，北京医用离心机厂)。

1.2试药靛玉红对照品(批号110717-200204，质量分数100%)、板蓝根对照药材(批号121117-200302)、大青叶对照药材(批号121367-200602)、忍冬藤对照药材(批号121069-201105)、(R，S)-告依春对照品(批号111753-201304，质量分数99.9%)，均由中国食品药品检定研究院提供；兰花颗粒(规格：12 g×10包/盒，批号：140807，140909，141013，第四军医大学口腔医院药剂科)；兰花颗粒(大青叶、板蓝根阴性，自制)；兰花颗粒(忍冬藤阴性，自制)；兰花颗粒(板蓝根阴性，自制)；甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯；水为超纯水。

2方法与结果

2.1定性鉴别

2.1.1大青叶、板蓝根TLC鉴别取本品2包，研细，加氯仿30 mL，加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加氯仿1 mL复溶，作为供试品溶液[8]。另取大青叶、板蓝根对照药材各1 g，同法制成大青叶、板蓝根对照药材溶液。再取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成1 mL含0.1 mg的对照品溶液。再取大青叶、板蓝根阴性样品24 g，按照供试品的制备方法制成阴性对照溶液。依照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取供试品溶液、对照品溶液、大青叶对照药材溶液、板蓝根对照药材溶液、阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。

图1大青叶与板蓝根薄层色谱图

1~3.供试品；4.靛玉红对照品；5.大青叶对照药材；6.板蓝根对照药材；7.阴性对照

Fig.1 TLC ofRadixisatidisandFoliumisatidis

1-3.sample solution；4.indirubin control substance；5.Foliumisatidisreference substance；6.Radixisatidisreference substance；7.negative control

2.1.2忍冬藤TLC鉴别取本品2包，研细，加体积分数为50%的甲醇40 mL，超声处理30 min，离心，取上清液作为供试品溶液[9]。另取忍冬藤阴性样品24 g,同法制成阴性对照溶液。再取忍冬藤对照药材1 g，加入体积分数为50%的甲醇10 mL，超声处理30 min，离心，取上清液作为对照药材溶液。依照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以体积分数为10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图2。

图2 忍冬藤薄层色谱图

1~3.供试品；4.忍冬藤对照药材；5.阴性对照

Fig.2 TLC ofCaulislonicerae

1-3.sample solution；4.Caulisloniceraereference substance；5.negative control

2.2含量测定

2.2.1色谱条件色谱柱：Spursil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(7∶93)；检测波长：245 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；理论板数按(R，S)-告依春峰计算应不低于5 000。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取(R，S)-告依春对照品5.05 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1.01 mg·mL-1的对照品母液。精密吸取该对照品母液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.10 mg·mL-1的对照品储备溶液。再量取对照品储备溶液0.38 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.52 μg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备取兰花颗粒5包,研细，混合均匀，取10 g，精密称定。加水100 mL，回流2 h，取出，放冷，加水补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4阴性对照溶液的制备取板蓝根阴性样品适量，按照2.2.3项下的方法制备阴性对照溶液。

2.2.5专属性实验精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按照2.2.1项下的色谱条件进样测定，结果显示，供试品溶液与对照品溶液的保留时间一致，阴性对照溶液在(R，S)-告依春相应的保留时间内未出现色谱峰，表明在该色谱条件下(R，S)-告依春的吸收良好，兰花颗粒中其他成分对(R，S)-告依春的测定无干扰。见图3。

图3HPLC图

a.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照；1.(R，S)-告依春

Fig.3 HPLC chromatograms

a. (R，S)-goitrin control substance；B.sample solution；C.negative control；1.(R，S)-goitrin

2.2.6线性关系考察精密量取对照品储备溶液0.30，0.60，0.90，1.20，1.50，1.80和2.10 mL,分别置于100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.30，0.61，0.91，1.21，1.52，1.82和2.12 μg·mL-1的对照品系列溶液。精密吸取上述对照品系列溶液各10 μL，按照2.2.1项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，以(R，S)-告依春对照品的峰面积(Y)对(R，S)-告依春的进样质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程：Y=59 879X+3 681.4(r=0.999 7)，表明(R，S)-告依春质量浓度在0.30~2.12 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.7精密度实验按照2.2.1项下的色谱条件，精密吸取(R，S)-告依春对照品溶液(1.52 μg·mL-1)10 μL，重复进样6次，每次10 μL，记录峰面积，计算其RSD为0.79%，表明仪器精密度良好。

2.2.8稳定性实验精密吸取同一供试品溶液10 μL，在0，2，4，6，8，10和12 h时，按照2.2.1项下的色谱条件，分别进样测定，记录其峰面积值，计算RSD为1.66%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.9重复性实验取同一批兰花颗粒(批号140807)内容物，按照2.2.3项下的方法，制备6份供试品溶液，并按照2.2.1项下的色谱条件进样测定，记录峰面积，结果显示,(R，S)-告依春的平均含量为14.31 μg·g-1，RSD为1.90%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.10加样回收率实验分别称取5.0 g已知含量(每克含有(R，S)-告依春14.31 μg)的兰花颗粒9份，精密称定，分别按照高、中、低质量浓度加入一定量的(R，S)-告依春对照品储备溶液，加水100 mL，回流2 h，取出，放冷，加水补足减失的质量，摇匀。精密吸取10 μL，然后按照2.2.1项下的色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1加样回收率实验结果

Tab.1 Results of the recovery tests

(n=9)

2.2.11样品含量测定精密称取3批兰花颗粒(批号140807，140909，141013)，按照2.2.3项下的制备方法进行制备，按照2.2.1项下的色谱条件进样测定，并计算样品中(R，S)-告依春的含量，分别为168.36，175.32和171.60 μg·袋-1，平均含量为171.76 μg·袋-1。

3讨论

在板蓝根的薄层鉴别中，笔者考察了以下条件：3种提取溶剂：体积分数为70%的乙醇[10]、稀乙醇[11]和乙酸乙酯[12]；3种展开系统：正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)[11]，三氯甲烷-甲醇(4∶1)[13]，三氯甲烷-丙酮-甲酸(5∶4∶1)[12]；2种显色剂：茚三酮试液[11]，磷钼酸试液[13]。对上述条件进行分析比较。用体积分数为70%的乙醇提取时，样品因含糖量过大，点样困难，干扰较大，薄层色谱图较难辨认，不予采用。尝试其余的方法，薄层色谱图均能呈现斑点，分离度良好，显色清晰的效果，但阴性均有干扰。由于处方中板蓝根和大青叶来源于同一植物，只是部位不同，两者含有共有成分，因此专属性不强。通过查阅相关文献[6]，最终选择用靛玉红鉴别制剂中的板蓝根和大青叶。

在(R，S)-告依春的含量测定中，考查了几种不同的流动相系统：甲醇-0.5 mL·L-1的磷酸溶液(7∶93)[14]、甲醇-0.2 mL·L-1磷酸溶液(7∶93)[15]、甲醇-水(7∶93)，结果发现效果无明显差异，故选择了甲醇-水(7∶93)为流动相系统。

板蓝根为本方的君药，其主要成分为(R，S)-告依春，故笔者在本质量标准研究中建立了(R，S)-告依春的含量测定方法。通过本实验建立的薄层鉴别方法和高效液相色谱含量测定方法对3批样品进行质量控制，发现本方法简便易行、灵敏度高、重复性好，可用于兰花颗粒的质量控制。

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Study on the quality standard of Lanhua Granules

KANG Yuxia1，2，LEI Wan2，WANG Ying2，GUO Feiyan2，WANG Xiaojuan2*(1.College of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China；2.State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Pharmacy，School of Stomatology，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China)

Abstract:Objective To establish the quality standard of Lanhua Granules. Methods Radix isatidis，Foliumi isatidis and Caulis lonicerae stem in Lanhua Granules were identified qualitatively by TLC.The content of (R，S)-goitrin in the preparation was determined by HPLC.The chromatographic column was Spursil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)， with methanol-water(7∶93) as the mobile phase， detection wavelength at 245 nm. Results Under the selected TLC conditions，the spots were clear，and the separation effect was good. (R，S)-goitrin showed a good linear relationship in the range of 0.30-2.12 μg·mL-1with r=0.999 7，and the average recovery was 87.5% with RSD 1.0% (n=9). Conclusion The method is specific，repeatable and simple, and can be used for the quality control of Lanhua Granules.

Key words:Lanhua Granules；(R，S)-goitrin; TLC；HPLC

(收稿日期：2015-06-11)

*通信作者：王晓娟，女，主任药师，硕士研究生导师

作者简介：康玉霞，女，在读硕士研究生

基金项目：口腔专科特色非标准制剂标准提高研究(编号：14ZJZ06)

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)02-0138-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.009