柱前衍生化HPLC法测定不同产地胡芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量

冯　欢，李新霞，冯　崴，李琳琳*(.新疆医科大学基础医学院药理教研室，乌鲁木齐　800；.新疆医科大学分析测试中心，乌鲁木齐　800；.金骏阳光生物科技有限公司，乌鲁木齐　800)



柱前衍生化HPLC法测定不同产地胡芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量

冯欢1，李新霞2，冯崴3，李琳琳1*(1.新疆医科大学基础医学院药理教研室，乌鲁木齐830011；2.新疆医科大学分析测试中心，乌鲁木齐830011；3.金骏阳光生物科技有限公司，乌鲁木齐830011)

摘要：目的柱前衍生化法测定4-羟基异亮氨酸含量。方法采用异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂，色谱柱(Zorbax Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，Agile)；流动相A：乙腈，流动相B：1 mL·L-1磷酸水，梯度洗脱(A相∶B相):(0~20 min，20∶80；20 min，60∶40)；流速：1.5 mL·min-1；进样体积：20 μL ；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃。结果4-羟基异亮氨酸在质量浓度4.2～20.9 μg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.999 3)，平均回收率为96.8%，RSD为1.7%。结论该方法简便、稳定，结果准确，可作为4-羟基异亮氨酸的含量测定方法。

关键词：胡芦巴；4-羟基异亮氨酸；柱前衍生化法；反相高效液相色谱法

胡芦巴为豆科植物胡芦巴属胡芦巴Trigonellafoenum-graecumL.的种子，具有温肾壮阳、祛寒除湿等功效[1]。胡芦巴作为一种药食两用的中药材，其含有的化学成分种类繁多，各类甾体皂苷、黄酮类化合物、氨基酸、生物碱等成分被认为是主要的功效成分。胡芦巴中的氨基酸有4-羟基异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸等。其中4-羟基异亮氨酸的含量占胡芦巴中游离氨基酸的80%以上[2]。近年来，国内外学者对4-羟基异亮氨酸的活性及其药理作用的研究结果表明，4-羟基异亮氨酸除了具有显著地降血糖活性外，还具有改善肝功能、降低血脂及胆固醇[3]、抗炎[4]、抗抑郁[5]等作用。

4-羟基异亮氨酸本身无紫外吸收，可通过HPLC-ELSD法测定胡芦巴[6]及胡芦巴提取物[7]中4-羟基异亮氨酸的含量，或者采用氨基酸柱前衍生化法测定含量[8]。本文采用异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂，通过反相高效液相色谱法测定不同产地胡芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量。

1仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(LC-20AB泵，SPD-20A紫外双波长检测器，日本岛津)；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；分析天平(AB135-S，梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2试药胡芦巴种子(新疆本草堂中药饮片公司，产地为山东、安徽、新疆，经新疆医科大学分析测试中心鉴定)；4-羟基异亮氨酸对照品，异硫氰酸苯酯(Sigma公司)；磷酸、三乙胺为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱(Zorbax Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent)；流动相A：乙腈；流动相B：1 mL·L-1磷酸水。梯度洗脱[A相∶B相](0~20 min，20∶80；20 min，60∶40)。流速：1.5 mL·min-1；进样体积：20 μL；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃。

2.2对照品溶液的制备取4-羟基异亮氨酸对照品2.0 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加入10 mL乙腈-水-三乙胺(40∶12∶8)溶解后，加入500 μL异硫氰酸苯酯，振摇5 min，加入60 mL甲醇，加水定容至刻度。

2.3供试品溶液的制备胡芦巴种子粉粹成粗粉，取胡芦巴粉2.0 g，精密称定，置于具塞试管中，加入8 mL甲醇-水(1∶1)，65 ℃水浴加热5 min，超声5 min，离心，取上清液，置于25 mL量瓶中，重复提取1次，合并2次提取液，置于25 mL量瓶中，用甲醇-水(1∶1)溶液稀释至刻度，得样品储备液。

取样品储备液5.0 mL，置于100 mL量瓶中，加入10 mL乙腈-水-三乙胺(40∶12∶8)溶液溶解后，加入500 μL异硫氰酸苯酯，振摇5 min，加入60 mL甲醇，加水定容至刻度，得到衍生化后的样品溶液，再取衍生化后的样品溶液5.0 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇-水(2∶1)溶液定容至刻度，混匀。进样前经0.22 μm的微孔滤膜器过滤，取续滤液备用。

2.4方法学验证

2.4.1专属性实验见图1。

图1HPLC图

a.空白；B.对照品；C.样品；1.4-羟基异亮氨酸

Fig.1 HPLC chromatograms

a.blank sample；B. reference substance；C.Trigonellafoenum-graecumL. sample；1.4-hydroxyisoleucine

2.4.2线性与范围精密量取对照品溶液2，4，6，8和10 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇-水(2∶1)定容至刻度，摇匀，得到系列标准溶液。分别进样20 μL，记录色谱峰面积A，以色谱峰面积A对质量浓度C(μg·mL-1)进行线性回归，得4-羟基异亮氨酸回归方程：Y=6.1×107X+15 852(r=0.999 3)，结果表明，4-羟基异亮氨酸在4.2～20.9 μg·mL-1范围内，与其色谱峰面积线性关系良好。

2.4.3精密度实验精密吸取对照品溶液，连续进样5次，每次进样20 μL，记录4-羟基异亮氨酸的峰面积，结果显示，RSD为0.73%，精密度良好。

2.4.4稳定性实验精密吸取同一供试品溶液，每隔2 h测定1次，连续进样7次，每次进样20 μL，记录4-羟基异亮氨酸的峰面积，RSD为0.78%。

2.4.5加样回收率实验取已知含量的同一批样品9份，精密称定，分别制备供试品溶液，精密加入高、中、低浓度的4-羟基异亮氨酸对照品溶液，按照2.3项下方法分别制备供试品储备液。按照2.1项下方法分析，4-羟基异亮氨酸的平均加样回收率为96.8%，RSD为1.7%。结果见表1。

表14-羟基异亮氨酸加样回收率实验结果

Tab.1 Results of 4-hydroxyisoleucine recovery test

(n=9)

3.5样品测定取新疆产、安徽产、山东产胡芦巴粉各2.0 g，精密称定，按照2.3项下方法，分别制备供试品溶液。进样前经0.22 μm的微孔滤膜器过滤，取续滤液备用。按照2.1项下方法，不同产地胡芦巴粉平行测定3次。新疆产胡芦巴中4-羟基异亮氨酸平均含量为0.49%，RSD为1.5%；安徽产胡芦巴中4-羟基异亮氨酸平均含量为0.48%，RSD为1.8%；山东产胡芦巴中4-羟基异亮氨酸平均含量为0.61%，RSD为0.94%。

4讨论

4-羟基异亮氨酸由于无紫外吸收，故对其含量测定的检测方法多采用蒸发光散射进行检测。而柱前衍生化法则可以将待测样品衍生化后通过不同检测器进行检测，方法更简便快速。对于柱前衍生化法，已有学者使用邻苯二甲醛作为衍生化试剂进行衍生化，但相比使用异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂，邻苯二甲醛的配制过程较复杂。

本实验参照美国草药典[9]，采用异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂，实验结果表明，经异硫氰酸苯酯衍生化后的溶液稳定，测定结果准确可靠。

参考文献：

[1]李波，曾光尧，谭健兵，等.柱前衍生化法测定胡芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量[J].中南药学，2009，7(4):277-279.

[2]史江华，李多伟，逄敏杰，等.胡芦巴研究新进展[J].西北药学杂志，2007，22(3):153-155.

[3]高峰，蔡琴，蔡伦，等.4-羟基异亮氨酸的研究现状[J].医药导报，2014，33(10):1261-1264.

[4]Claude dal Farra, Vincience. Anti-inflammatory properties of 4-hydroxyisoleucin extract[J].J Am Acad Dermatol，2007，56(2):AB29

[5]Vaibhav Gaur，Subhash L., Bodhankar，et al.Antidepressant-like effect of 4-hydroxyisoleuine fromTrigonellafoenumgraecumL. seeds in mice[J]. Biomed Aging Pathol，2012，2(3):121-125.

[6]房杰，刘智宇，熊正涛，等.HPLC-ELSD测定胡芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量[J].华西药学杂志，2004，19(5):355-356.

[7]惠玉虎，杨朝昆，寇玉锋，等.HPLC-ELSD法测定胡芦巴提取物中4-羟基异亮氨酸[J].中草药，2007，38(1):60-61.

[8]孔彬，巴吐尔·买买提明，马晓丽，等.柱前衍生RP-HPLC荧光检测法测定人血浆中17种氨基酸[J].西北药学杂志，2013，28(2):141-144.

[9]American Herbal Pharmacopoeia[S].2014.

Determination of 4-hydroxyisoleucine in the seeds ofTrigonellafoenum-graecumL. from different habitats by precolumn derivatization HPLC

FENG Huan1，LI Xinxia2，FENG Wei3，LI Linlin1*(1.Department of Pharmacology，Basic Medicine College，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Analytical and Testing Center of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；3.Jinjun Yangguang Biotechnology Limited Company，Urumqi 830011，China )

Abstract:Objective To establised a method for the determination of 4-hydroxyisoleucine in the seeds of Trigonella foenum-grae-

cumL. from different habitats. Method Precolumn derivatization HPLC was adopted using phenylisothiocyanate as the derivative reagent. Zorbax Eclipse XDB-C18column was used. The mobile phase was A [acetonitrile]∶B [1 mL·L-1phosphoric acid in water] (0-20 min，20∶80；20 min，60∶40)，with a flow rate of 1.5 mL·min-1at 30 ℃. Result A good linearity was obtained in the range of 4.2-20.9 μg·mL-1(r=0.999 3) for 4-hydroxyisoleucine. The average recovery of 4-hydroxyisoleucine was 96.8%，RSD=1.7%. Conclusion Using phenylisothiocyanate as the derivative reagent，the precolumn derivatization HPLC method is simple，reproducible and accurate.

Key words:Trigonella foenum-graecum L.；4-hydroxyisoleucine；precolumn derivatization；HPLC

(收稿日期：2015-06-23)

*通信作者：李琳琳，女，教授，博士生导师

作者简介：冯欢，女，硕士研究生

基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目(编号：201233150)；吉林大学-新疆医科大学联合基金项目(编号： 01040050503)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)02-0136-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.008