正交实验优化新疆沙棘果渣总黄酮的提取工艺

帕塔尔·尼牙孜，邱远金，王婷媛，朱国强，贾晓光，蔡永国(.新疆大学生命科学院，乌鲁木齐　80049；.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐　8000；新疆慧华沙棘生物科技有限公司，阿勒泰　8600)



正交实验优化新疆沙棘果渣总黄酮的提取工艺

帕塔尔·尼牙孜1，邱远金2*，王婷媛2，朱国强2，贾晓光2，蔡永国3(1.新疆大学生命科学院，乌鲁木齐830049；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐830002；3新疆慧华沙棘生物科技有限公司，阿勒泰836200)

摘要：目的对新疆青河县沙棘果渣中总黄酮的提取工艺进行正交优化。方法通过单因素实验，确定实验因素与水平；采用正交实验设计法优化沙棘果渣总黄酮的提取工艺条件。结果最佳工艺条件：乙醇体积分数为50%，提取时间为1.5 h，料液比为1∶20，提取3次。在此优化条件下,沙棘果渣总黄酮含量可达53.73 mg·g-1。结论新疆青河县沙棘果渣总黄酮含量高。优化了沙棘果渣总黄酮提取工艺，工艺操作简单，提取率高，为产业化生产提供指导和理论依据。

关键词：沙棘；沙棘果渣；总黄酮；正交实验

沙棘(HippophaerhamnoidesL.) 为胡颓子科(Elaeagnaceae)酸刺属的灌木或小乔木，又名沙枣、醋柳果、酸刺、黑刺、酸溜溜，在我国分布广泛[1]。我国是世界上沙棘资源最丰富的国家，占全世界沙棘资源的99%以上[2]。新疆拥有丰富的沙棘资源，南北疆均有分布，由于光热资源丰富，其果实、叶中富含多种生物活性物质与营养成分[3]。沙棘的果实、叶子和果渣中均含有丰富的黄酮类化合物[4]。沙棘具有缓解心脏疾病、保肝、改善血液循环、治疗咳嗽、免疫调节特性、抗氧化、抑制血小板聚集等多种功能[5]，并富含不同的生物活性物质，包括黄酮类、不饱和脂肪酸、甾醇、矿物质、茶多酚、维生素E、类胡萝卜素等[6]。沙棘果汁、沙棘油等沙棘产品的生产带来经济效益的同时，也产生了沙棘资源的浪费和环境污染等安全隐患。研究正交实验设计法优化沙棘果渣总黄酮的提取工艺条件，建立优化的沙棘果渣总黄酮提取工艺，指导对沙棘果渣黄酮类产品的研究开发和利用，对促进沙棘相关产业经济发展和生态保护具有重要意义。

1仪器与试药

1.1仪器紫外分光光度计(BECKMAN Du-7)；旋转蒸发器RE-3000；恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；酒精计(冀州市耀华器械仪表厂)；电子天平(上海科学仪器仪表有限公司)。

1.2试药沙棘果渣(新疆慧华沙棘生物科技有限公司提供)；芦丁对照品(批号11040，中国食品药品检定研究院)；乙醇(天津市百世化工有限公司)。

2方法

2.1沙棘果渣黄酮的提取取沙棘果渣2 g，精密称定，加入体积分数为60%的乙醇30 mL，加热回流提取2 h，冷却至室温，滤过，残渣分别再加入体积分数为60%的乙醇25 mL，回流提取2次，每次1 h，滤过，合并滤液，置于100 mL量瓶中，残渣用体积分数为60%的乙醇洗涤，洗液并入量瓶中，用体积分数为60%的乙醇定容至刻度，摇匀，测定总黄酮的含量。

2.2总黄酮的测定方法采用硝酸铝络合分光光度法测定黄酮含量[7]。

2.2.1标准曲线的绘制取芦丁对照品20 mg，精密称定，用体积分数为60%的乙醇定容至100 mL，备用。精密量取对照品液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，各加入体积分数为30%的乙醇至6.0 mL，加质量浓度为50 g·L-1的亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加质量浓度为100 g·L-1的硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol·L-1的氢氧化钠试液10 mL，再加体积分数为30%的乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白对照，按照紫外-可见分光光度法(附录ⅤA)，在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、总黄酮质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=11.313X-0.005 4(X：质量浓度，mg·mL-1；Y：吸光值)，r= 0.999 6。

2.2.2沙棘果渣黄酮含量的测定取沙棘果渣提取液1 mL，置于25 mL量瓶中，按照上述标准曲线制作的方法测定吸光度，根据标准曲线方程计算质量浓度C(mg·mL-1)，由质量浓度计算沙棘果渣总黄酮提取量(mg·g-1)。

2.3单因素实验

2.3.1乙醇体积分数对黄酮提取量的影响取1 g沙棘果渣8份，精密称定，按料液比1∶20，分别加入体积分数为20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%和90%的乙醇溶液，精密称定，水浴加热回流，提取1次，2 h。提取结束后，放冷，称定，加相应体积分数的乙醇补足减失的量，过滤，测定总黄酮含量，平行3次测定，取平均值。

2.3.2料液比对黄酮提取量的影响取1 g沙棘果渣5份，精密称定，乙醇体积分数为60%，分别以1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50的料液比，水浴加热回流提取1次，2 h。提取结束后，放冷，称定，加相应体积分数乙醇补足减失的量，过滤，测定总黄酮含量，平行测定3次，取平均值。

2.3.3提取时间对黄酮提取量的影响取1 g沙棘果渣5份，精密称定，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶35，分别水浴加热回流提取1，2，3，4和5 h，1次。提取结束后，放冷，称定，加相应体积分数的乙醇补足减失的量，过滤，测定总黄酮含量，平行测定3次，取平均值。

2.3.4提取次数对黄酮提取量的影响取1 g沙棘果渣4份，精密称定，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶35，分别水浴加热回流提取1，2，3和4 次，2 h。提取结束后，放冷，称定，加相应体积分数的乙醇补足减失的量，过滤，测定总黄酮含量，平行测定3次，取平均值。

2.4正交实验设计分析根据单因素实验结果，选取乙醇体积分数、提取时间、料液比和提取次数4个因素，以黄酮提取量为考察指标设计实验，因素及水平见表1。

表1正交实验因素与水平

Tab.1Factors and levels in the orthogonal experimental design

水平A．乙醇体积分数/%B．提取时间/hC．料液比/g·mL-1D．提取次数/次15011∶20126021∶25237031∶303

3结果与分析

3.1乙醇体积分数对沙棘果渣黄酮提取量的影响结果表明，沙棘果渣黄酮提取量随着乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数为60%时达到最大。当乙醇体积分数增加到60%之后，沙棘果渣总黄酮提取量有所下降。黄酮类化合物种类多，结构各异。黄酮类化合物的溶解特性因极性不同而有差异。沙棘果渣黄酮类化合物中含有多种成分，有苷元类物质也有黄酮苷类物质，选择合适的乙醇体积分数有利于最大程度地提取沙棘果渣总黄酮。

3.2料液比对沙棘果渣黄酮提取量的影响结果表明，沙棘果渣黄酮提取量随着料液比的增加而增加，料液比为1∶35时达到最大值。当料液比增加到1∶35之后，其增加量对黄酮提取量的影响不大。料液比越大溶剂用量越大，有利于黄酮的溶出，但当达到最大的溶解度后黄酮类化合物基本提取完全，黄酮提取量不再增加，继续增加料液比会造成溶剂和能源的浪费。

3.3提取时间对沙棘果渣黄酮提取量的影响结果表明，随着提取时间的增加，沙棘果渣黄酮提取量增加，提取时间为2 h时达到最大值。因此，提取时间的增加对沙棘果渣黄酮提取量影响不大。

3.4提取次数对沙棘果渣黄酮提取量的影响结果表明，沙棘果渣黄酮提取量随着提取次数的增多而增加，提取次数为4次时达到最大值。当提取次数为3次之后，沙棘果渣黄酮提取量缓慢增加，但对提取量的影响不大。

3.5正交实验设计分析选取乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数进行正交实验设计。按照4因素3水平正交实验进行9次实验，每次实验平行2次。正交实验安排和结果见表2。方差分析结果见表3。

表2L9(34)正交实验结果

Tab.2 Results of L9(34) orthogonal experiment

项目ABCD黄酮提取量/mg·g-11111136．29092122219．13913133350．76574212344．78535223131．61516231218．53627313218．00478321343．03019332134．0289K135．39933．02732．61933．978K231．64631．26132．65118．560K331．68834．44433．46246．194R3．7533．1830．84327．634

表3方差分析结果

Tab.3 Results of variance analysis

因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性A27．856220．34819．000*B15．250211．14019．000C1．36921．00019．000D1150．5622840．44019．000*误差1．3702

注：差异显著，*P<0.05；差异极显著，**P<0.01。

对正交实验结果进行极差分析，极差R的大小显示影响因素的主次，由R值大小可知，不同因素对沙棘果渣黄酮提取量的影响程度不同。表2表明，沙棘果渣总黄酮提取率的影响因素大小顺序为:提取次数(D)>乙醇体积分数(A)>提取时间(B)>料液比(C)。由表3可知，正交实验方差分析有显著性差异。提取次数和乙醇体积分数对提取量有显著的影响。提取时间和料液比没有显著影响。

综合单因素和正交实验结果分析，最佳提取工艺参数为:乙醇体积分数为50%，提取时间为1.5 h，料液比为1∶20，提取3次。

3.6重复验证实验为进一步考察上述优选工艺条件的稳定性，按照最佳工艺条件：乙醇体积分数为50%，提取时间为1.5 h，料液比为1∶20，提取3次，进行5个平行实验，对最佳提取工艺进行验证。结果表明，在最佳工艺条件下沙棘果渣总黄酮含量可达53.73 mg·g-1。

4结论

通过研究单因素实验，确定实验因素与水平。乙醇是对人体无害的提取剂，选择合适的乙醇体积分数能有效地提取活性成分。在生产中，提取时间过短，黄酮类化合物不能完全溶解在提取剂中，时间过长则会耗时耗资。同样料液比和提取次数的增加会提高生产成本，延长生产周期，消耗资源。本实验研究建立的沙棘果渣总黄酮提取工艺，操作简单，提取率高，对青河县沙棘果渣黄酮新技术、新方法、新工艺的研究提供了基础数据，同时也为我国沙棘果渣资源的充分利用、研究开发和产业化生产提供了依据。

从对我国沙棘资源的利用角度来说，新疆青河县沙棘果渣总黄酮的提取工艺研究范围相对小，种类单一，应进一步扩大对其他地区和不同品种的沙棘进行深入研究。新疆气候条件比较特殊，沙棘的品种和其活性成分的含量与其他地区有差异。建议进一步加大对不同地区沙棘活性成分的提取研究，更进一步了解对活性成分提取的影响因素，实验工艺条件应做到符合实际生产。

参考文献：

[1]王锦秋，王民．沙棘的制剂开发与应用现状[J].西北药学杂志，2006，21(6):278-279.

[2]利毛才让，索有瑞．正交设计优化沙棘果中总酚酸的提取工艺[J].西北药学杂志，2011，26(2)：82-84.

[3]张益娜，谢琼，李敏，等．新疆沙棘叶总黄酮的微波辅助提取和鉴别[J].新疆农业科学，2007，44(6)：761-764．

[4]李繁．沙棘的研究进展[J].中国医药导报，2009，6(1):7-8．

[5]Zu Y， Li C， Fu Y， et al. Simultaneous determination of catechin，rutin，quercetin kaempferol and isorhamnetin in the extract of sea buckthorn (HippophaerhamnoidesL.) leaves by RP-HPLC with DAD[J]. J Pharm Biomed Aanl，2006，41(3):714-719.

[6]Elga D- nç，Dalija Segliòa，Ruta Galoburda，et al.Content of phenolic compounds in various ses buckthorn parts[J].Proc L Aca Sci，2013，67(4):411-415.

[7]Kim D O，Jeong S W，Lee C Y.Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums[J].Food Chem，2003，81(3):321-326.

Optimization of extraction procedure of flavonoids from Xinjiang seabuckthorn residues using orthogonal experiment

Pataer NIYAZI1，QIU Yuanjin2*，WANG Tingyuan2，ZHU Guoqiang2，JIA Xiaoguang2，CAI Yongguo3(1.College of Life Sciences，Xinjiang University，Urumqi 830049，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Chinese Medicine and Ethnic Medicine Research Institute，Urumqi 830002，China；3.Xinjiang Huihua Seabuckthorn Biological Science and Technology Limited Company， Aletai 836200，China )

Abstract:Objective To study on the optimal extraction procedure of flavonoids from the residues of seabuckthorn cultivated in Qinghe county，Xinjiang. Methods The experimental factors and levels were designed by an orthogonal experimental design method. Results The optimal conditions for extracting flavonoids from seabuckthorn residues were as follows: 50% ethanol volume fraction，1.5 h extraction time，1∶20 liquid-to-solid ratio，three times of extraction. Under these optimized conditions，the extraction ratio of flavonoids could reach up to 53.73 mg·g-1. Conclusion Flavonoids content is high in the residues of seabuckthorn cultivated in Qinghe county，Xinjiang.The optimized extraction procedure is executable with high extraction ratio.

Key words:seabuckthorn；seabuckthorn residues；flavonoids；orthogonal experiment

(收稿日期：2015-06-23)

*通信作者：邱远金，男，助理研究员

作者简介：帕塔尔·尼牙孜，男，硕士研究生

基金项目：新疆维吾尔自治区公益性科研项目(编号：KY2015126)

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)02-0119-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.003