运动训练对脑梗死大鼠室管膜下区神经新生的影响①

方杰，胡昔权



运动训练对脑梗死大鼠室管膜下区神经新生的影响①

方杰1，胡昔权2

[摘要]目的探讨大鼠脑梗死后跑笼训练对室管膜下区神经新生及神经功能恢复的影响。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，线栓法阻塞左侧大脑中动脉建立脑梗死模型，随机分为对照组(n=24)和训练组(n=24)，两组再分为3 d、7 d、14 d和21 d亚组，每个亚组6只。对照组于普通笼内饲养，不做任何针对性训练；训练组予跑笼训练每天2次，共3周。各亚组于预定时间采用神经功能损伤严重程度量表(NSS)评估神经功能，取材行Ki67免疫荧光染色。结果14 d和21 d时，训练组Ki67阳性细胞数较对照组增多(P<0.05)。7 d后，训练组NSS评分低于对照组(P<0.05)。结论脑梗死后跑笼训练可促进大鼠室管膜下区神经新生，可能在脑梗死后神经功能恢复的过程中发挥重要作用。

[关键词]脑梗死；运动训练；神经新生；大鼠

作者单位：1.广州医科大学附属第二医院康复医学科，广东广州市510260；2.中山大学附属第三医院康复医学科，广东广州市510630。作者简介：方杰(1984-)，男，汉族，安徽淮南市人，硕士，主治医师，主要研究方向：康复医学与理疗学。通讯作者：胡昔权，教授，博士生导师。E-mail: xiquhu@hotmail.com。

[本文著录格式]方杰，胡昔权.运动训练对脑梗死大鼠室管膜下区神经新生的影响[J].中国康复理论与实践, 2016, 22(1): 8-12.

CITED AS: Fang J, Hu XQ. Effect of wheel running on neurogenesis in subventricular zone of adult rats post cerebral ischemia [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(1): 8-12.

一直以来，成年哺乳动物神经元被认为是永久性细胞，受损后无法恢复，仅能通过胶质细胞填充，并且随着年龄增长逐渐退化和减少。1992年，Reynolds等从成年小鼠纹状体分离出能在体外不断分裂增殖、具有多种分化潜能的细胞群，提出了神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的概念[1]。成年哺乳动物的NSCs主要存在于侧脑室的室管膜下区(subventricular zone, SVZ)、纹状体和海马齿状回(dentategyrus,DG)。已有研究证实，脑缺血等病理刺激可激活成体脑内NSCs增殖[2]。

目前国内外研究大多侧重于脑缺血对NSCs激活的影响，也有少数研究针对脑缺血后运动训练对海马齿状回NSCs增殖的影响。本研究探讨脑梗死后运动训练对室管膜下区NSCs增殖的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

清洁级雄性成年Sprague-Dawley大鼠70只，由广东省实验动物中心提供，合格证号SCXK(粤) 2008-0002，体质量230～250g，3月龄。造模后符合纳入标准的大鼠48只，随机数字表法分为对照组、训练组各24只，再分为术后3 d、7 d、14 d和21 d，每时间点6只。所有动物均普通笼饲养，予充足饮食，每天日照12 h，室温(25±3)℃。

1.2模型制备

大鼠术前禁食12 h。采用Longa等的线栓法[3]制作永久性左侧大脑中动脉闭塞模型。3.5%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，取颈正中切口，钝性分离皮下筋膜及甲状腺，将左侧甲状腺外翻并保护固定。充分暴露视野，分离大鼠左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉主干和颈总动脉近心端，并在颈总动脉远心端备线，分离颈内动脉至翼腭动脉，动脉夹夹闭颈内动脉近心端，在颈总动脉主干分叉处剪一约0.2 mm的“V”形切口，插入顶端稍有膨大的尼龙线栓(北京沙东生物科技有限公司)，缓慢推进至线栓顶端有阻力感，插入深度从颈总动脉分叉处计算约(18±0.5) mm，使线栓经颈总动脉分叉部顺利通过颈内动脉，越过大脑中动脉开口处，到达大脑前动脉起始部。结扎备线，复位甲状腺，关闭缝合切口。麻醉清醒后回笼，自由进食。

动物清醒后采用改良Bederson标准[4]进行神经功能评分：0分，无神经功能缺失体征；1分，提尾时损伤对侧前肢屈曲；2分，前肢屈曲及对侧抵抗力下降；3分，向对侧转圈；4分，向对侧转圈及意识障碍。选择苏醒后出现左眼Honer氏征阳性、Bederson评分1～3分的大鼠纳入研究。

1.3运动训练

采用自行研发的实验动物跑笼训练器。跑笼直径20 cm，长40 cm，由电动马达带动，控制器设定转速、时间或路程。训练组造模48 h后开始训练，采用阶梯式递增训练法，初始转速5 r/min，每次15 min，每天2次。7 d后逐步增加为5 r/min，10 min；10 r/min，5 min；15 r/min，10 min；每天2次。14 d后逐步增加为15 r/min，10 min；20 r/min，10 min；15 r/min，10 min；每天2次。

对照组不进行干预，自由活动。

1.4神经功能评分

术后3 d、7 d、14 d和21 d采用神经功能损伤严重程度量表(neurological severity scores, NSS)[5]进行评定。该量表包括运动功能、感觉功能、平衡和反射缺失、异常运动4部分，共18分。1～6分为轻度损伤，7～12分为中度损伤，13～18分为重度损伤。

1.5免疫荧光染色

大鼠3.5%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，剪开前胸壁，纵向剪开心包，充分暴露心脏。肝素钠0.2 μl抗凝，在心尖偏左处左心室插管至升主动脉，止血钳固定针头，剪开右心耳，快速滴入4℃生理盐水50～100 ml冲洗，4℃4%多聚甲醛200～250 ml灌注固定，先快后慢，40 min灌注完。立即开颅取脑，组织块后固定在4%多聚甲醛中。脑组织分别置20%、30%、40%梯度蔗糖磷酸盐缓冲溶液内，直到组织块沉底。取出组织，恒冷箱切片机由颅至尾依次连续切片，片厚20 μm，隔4片取1片，裱于玻片上，行免疫荧光染色。

冰冻切片晾干后，0.01 mol/L PBS (pH=7.4)漂洗3次，每次5 min；置煮沸的0.01 mol/L柠檬酸钠抗原修复液中(pH=6.0)，微波加热持续煮沸20 min，室温冷却；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；3% H2O2室温5 min；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；1% TritonX-100室温下破膜30 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；加入山羊血清，室温封闭30 min；弃去血清，加入兔Ki67单克隆抗体(ABACAM，1∶1000)，4℃过夜，弃去一抗；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔Cy3 (PROTEINTECH，1∶100)，避光孵育1 h；0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；室温下晾干。抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察。每只动物取3张切片，400倍镜下随机取3个视野，使用Image-pro plus 6.0软件计数Ki67阳性细胞。

1.6统计学分析

所有数据采用SPSS 16.0版软件进行数据统计分析。数据以(±s)表示，行单因素方差分析(One-way analysis of variance)。显著性水平α=0.05。

2　结果

两组造模3 d后NSS评分逐渐下降。术后3 d时，两组间评分无显著性差异(P>0.05)；从术后7 d开始，训练组NSS评分低于对照组(P<0.05)。组内比较，对照组3 d和7 d的NSS评分无显著性差异(P>0.05)，14 d后降低(P<0.05)；训练组术后7 d即有降低(P< 0.05)。见表1。

两组从术后3 d开始出现Ki67阳性细胞，7 d达到高峰，14 d后增殖水平逐渐下降(图1)。术后3 d和7 d，两组间Ki67阳性细胞数无显著性差异(P>0.05)；术后14 d和21 d，训练组Ki67阳性细胞数多于对照组(P<0.05)。组内比较，训练组术后3 d与14 d时，Ki67阳性细胞数无显著性差异(P>0.05)，其余各时间间均有显著性差异(P<0.05)；对照组各时间点间Ki67阳性细胞数均有显著性差异(P<0.05)。见表2。

表1　两组不同时间点NSS评分比较

表2　两组不同时间点Ki67阳性细胞数比较

图1　各组不同时间点Ki67表达(免疫荧光染色, bar=50 μm)

3　讨论

NSCs是来源于神经系统，具有自我维持或自我更新能力，并可向神经组织多细胞系(神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞)分化的细胞。目前，利用NSCs修复缺血性脑损伤主要有两种途径：移植外源性NSCs和激活内源性NSCs。NSCs移植面临成瘤风险、毒性、免疫排斥以及社会伦理等问题，应用受到限制；诱导内源性NSCs逐渐成为研究热点。

哺乳动物成年后，NSCs主要存在于侧脑室壁室管膜下区和海马齿状回的颗粒细胞层。一般认为，脑室下区-头侧突起-嗅球系统中，脑室下区新生的NSCs由神经胶质细胞包裹，并沿腹侧迁移通路向嗅球方向迁移，形成成熟的中间神经元[6]。在颗粒细胞下区-颗粒细胞层系统中，颗粒细胞下区新生的NSCs在迁移过程中，逐渐分化为前体细胞进入颗粒细胞层，进一步形成神经细胞[7]。

目前鉴定NSCs最常用的方法是免疫组化示踪法，利用细胞增殖标记物，如胸腺嘧啶核苷类似物5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine, BrdU)，多由腹腔注射至动物体内[8]。BrdU可在细胞周期的S期掺入细胞核DNA内，通过免疫组化染色进行检测。

但这种方法存在着一些争议和不足。首先，此种标记方法属于有创性操作，对动物产生一定的刺激，仅限用于活体动物；而且随着操作人员的技术、方法以及剂量掌握而存在差异，增加了实验的干扰因素。其次，BrdU的掺入只意味着有DNA合成，不一定存在细胞分裂，受损的DNA在进行修复时，或处于即将衰老凋亡的细胞周期，核苷类似物也可以掺入其内，BrdU无法区分正处于修复、即将死亡和增殖细胞[9]。此外，注射入动物体内的BrdU是否会随着细胞的分裂增殖而衰减或被稀释，也存在一定争议。

随着NSCs研究的深入，Ki67开始逐渐广泛应用于NSCs的研究中[10-12]。Ki67在细胞周期的G1后期、S期、G2期和M期细胞核表达，是内源性抗原，可直接进行免疫组化检测；相比外源性注射抗原，表达部位和表达量更加稳定；且只表达于增殖中的细胞，不会出现于修复期或即将衰亡的细胞中，是理想的NSCs鉴定标记物之一。

成年哺乳动物体内NSCs数量极少，仅依赖自发的内源性NSCs修复脑损伤远远不够。提高内源性NSCs的增殖水平，是缺血后神经再生的基础。目前研究认为，激活NSCs的因素如下。

内源性因素指可以对外界信号发生反应，并通过一系列信号转导，调节自身NSCs的因素，包括一些NSCs内的蛋白成分、神经营养因子等。另外，一些转录因子和基因的激活与沉默也可介导NSCs向特定的终末方向分化。各种生长相关的因子、离子、激素以及神经介质，也都是NSCs赖以存在和分化的必要因素。

外源性因素包括葡萄糖、氨基酸、维生素等，是维持细胞存活的基本元素，任何物质的缺乏都会导致NSCs功能丧失甚至死亡。细胞间各种因素的协调平衡、渗透压、pH值、氧浓度和温度等都对NSCs的增殖、迁移以及分化产生重要影响。病理状态如脑缺血也是NSCs的激活因素[13]。有研究发现，脑缺血后10 d 和30 d分别在室管膜下区和腹侧迁移通路出现细胞增殖高峰，在30 d和60 d可在嗅球检测到BrdU和NeuN双阳性细胞，提示NSCs的增殖、迁移和分化[14]。越来越多的研究发现，给予脑梗死动物运动训练、丰富环境、电针[15]等刺激，也可以提高NSCs的增殖水平。

给予成年小鼠运动训练后，可提高运动功能、学习记忆能力[16]。该作用与激活海马区神经新生、改善突触可塑性有关。本研究显示，脑缺血发生后早期，对照组及训练组大鼠室管膜下区均出现大量Ki67阳性细胞，可能与损伤后的缺血缺氧状态激活脑内源性神经新生有关。一段时间后，随着细胞水肿的减轻、脑内侧支微循环的建立以及胶质细胞填充、分泌一些神经营养因子，运动功能逐渐恢复，同时神经新生的增殖水平也明显下降。而运动训练有助于维持大鼠室管膜下区Ki67阳性细胞水平，虽然14 d时细胞的增殖水平较前有所下降，但仍明显高于对照组。这一促进作用可能与激活某些细胞信号通路，如Wnt通路等有关[17]；也有研究发现，脑缺血后运动训练可通过激活基质细胞衍生因子-1及其受体(SDF-1α/CXCR4)轴，促进NSCs增殖、迁移至损伤部位，发挥修复作用。相比训练组，对照组在14 d时，大鼠室管膜下区细胞增殖水平较7 d时已明显下降，21 d时进一步下降，说明脑缺血损伤刺激对室管膜下区神经新生的激活作用有限，无法发挥有效的修复作用。

神经功能评估也发现，7 d、14 d和21 d训练组神经功能优于对照组。我们前期的研究显示，运动训练能促进脑梗死大鼠运动功能的恢复，且明显优于自然恢复[18-19]。结合本研究的发现，提示脑梗死大鼠神经功能的恢复可能与运动训练促进脑缺血后室管膜下区神经新生有关。

综上所述，脑缺血后运动训练可激活室管膜下区神经新生，促进NSCs增殖、迁移和分化，对受损的神经系统进行修复。今后应加强对影响脑缺血后NSCs增殖、迁移和分化因素的研究，选择合适的训练方式、训练强度以及训练介入时间，提高NSCs增殖水平和存活能力，促进其向受损部位的迁移能力和向神经元方向分化，重建正确的神经网络。

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Effect of Wheel Running on Neurogenesis in Subventricular Zone of Adult Rats post Cerebral Ischemia

FANG Jie1, HU Xi-quan2
1. Department of Rehabilitation, The Second Affiliated Hospital ofguangzhou Medical University,guangzhou,guangdong 510260, China; 2. Department of Rehabilitation, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,guangzhou,guangdong 510630, China
Correspondence to HU Xi-quan. E-mail: xiquhu@hotmail.com

Abstract:Objective To observe the effect of wheel running exercise on subventricular zone neurogenesis and the neural function in rats post cerebral ischemia. Methods 48 adult male Sprague-Dawley rats were induced cortical infarcts with left middle artery occlusion and were housed in either standard (controlgroup, n=24) or wheel running (exercisegroup, n=24). They were assessed with neurological severity scores (NSS), and the expression of Ki67 was determined with immunofluorescence, 3, 7, 14 and 21 days after training. Results Compared with the controlgroup, the number of Ki67-labeled cells in subventricular significantly increased in the exercisegroup 14 and 21 days after ischemia (P<0.05), and the NSS decreased since 7 days after ischemia (P<0.05). Conclusion Wheel running may promote the neurogenesis in subventricular of adult rats after cerebral infarction, which may associate with the recovery of neural function.

Key words:cerebral infarction; exercise; neurogenesis; rats

(收稿日期：2015-05-17修回日期：2015-09-30)

[中图分类号]R743.32

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2016)01-0008-05

基金项目：1.国家自然科学基金项目(No.81071607)；2.广东省科技计划项目(No.2011B060300013)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.01.002