Sox30基因在大鼠睾丸发育中的表达与甲基化分析

马学翔, 董　严, 韩　飞, 李小娜, 时小燕, 陈洪强, 郝翔麟, 刘晋祎

(第三军医大学 毒理学研究所, 重庆, 400038)



Sox30基因在大鼠睾丸发育中的表达与甲基化分析

马学翔, 董严, 韩飞, 李小娜, 时小燕, 陈洪强, 郝翔麟, 刘晋祎

(第三军医大学 毒理学研究所, 重庆, 400038)

摘要:目的分析Sox30基因在大鼠胚胎发育以及性腺中的表达和甲基化情况。方法取大鼠胚胎发育不同时期组织、出生后至73 d雌雄大鼠性腺和成年不同组织，利用RT-PCR分析该基因的表达情况。利用亚硫酸氢钠处理后测序法 (BSP)分析Sox30基因甲基化发生情况。结果Sox30基因在大鼠胚胎发育10.5 d就开始表达；出生后Sos30主要在睾丸中表达，且表达逐渐增加，而在卵巢、子宫中不表达；成年大鼠的脑、心、肝、肾、脾、胰、肺、垂体、肠、肌肉、海马等组织中该基因低表达或者不表达。Sox30表达受甲基化调控，低表达或者不表达组织中该基因明显高甲基化。结论Sox30基因表达受到其启动子区域甲基化调控，成年大鼠中该基因仅在睾丸中高表达，表明该基因与雄性性别发育以及睾丸的功能维持有关。

关键词:Sox30基因; DNA甲基化; 睾丸

SOX 家族是一类SRY相关基因构成的基因家族, 该家族的所有成员均含有一个HMG-box DNA 结合域, 因此属于核转录因子蛋白。该家族成员主要参与一些细胞分化、胚胎发育过程中的一些调控，尤其是在早期发育中有一定的组织特异性，因此被认为是目标特异性的转录因子蛋白[1]。

Sox30基因是Sox基因家族H亚族的唯一成员，首先从小鼠和人类中分离得到，基因表达分析结果[2]显示，Sox30基因表达于雄性性腺的生殖细胞。作者前期研究结果揭示，Sox30是一个与睾丸发育密切相关的重要基因，而且其表达模式受其DNA甲基化变化的调控[3]。然而，Sox30基因是否和大鼠睾丸发育相关以及其表达模式与其DNA甲基化是否存在联系还不得而知。

本研究对成年大鼠各组织和发育各阶段的睾丸中Sox30基因的表达和DNA甲基化进行了系统分析。研究结果显示，Sox30只在成年大鼠的睾丸组织中大量表达，而在其他组织中不表达或者表达量很低；Sox30基因在睾丸中随着发育其表达量持续升高，40 d后达到峰值并维持较高表达量；Sox30在成年大鼠各组织和发育各阶段睾丸中的表达受DNA甲基化的调控。因此，Sox30是一个受DNA甲基化调控且与大鼠睾丸发育或者功能维持密切相关的重要基因。

1材料与方法

1.1动物及取材

大鼠购自第三军医大学大坪医院，动物在恒定温度(25 ℃)、50%～60%相对湿度、每天12 h光照/黑暗、水和食物自由采食条件下饲养。将性成熟的雄性大鼠和雌性大鼠于下午合笼，阴道涂片检查有白色阴栓时，雌性大鼠受孕成功，即为孕期1 d。颈椎脱臼法处死大鼠后用常规方法取大鼠的胚胎、睾丸及其他组织器官，所有组织器官冻存于液氮备用。

1.2基因组DNA和总RNA提取

DNA提取参照Promega公司DNA纯化提取试剂盒使用说明书进行，DNA样品定量后保存在-20 ℃备用。用TRIzol法分别提取组织样品总RNA，RNA定量后保存于-80 ℃备用。

1.3Sox30亚硫酸氢测序PCR(BSP)测序

DNA样品使用EZ DNA甲基化修饰试剂盒(Zymo Research，D5005)进行修饰，然后进行PCR扩增。BSP扩增引物序列为: Primer1: 5-AAGGTTTAAAAG ATTTTAATAGATT-3; Primer2: 5-TCTAAACCTTATTCTTAATTACCCC-3; 取1 μL修饰后的DNA进行扩增；PCR扩增条件: 95 ℃ 3 min，95℃ 40 s, 66℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 10个循环，95 ℃ 40 s，58 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 30个循环, 72 ℃ 10 min。PCR产物经2%琼脂糖电泳证实。将琼脂糖胶电泳上目的DNA片段切下，按照Omega胶回收试剂盒纯化目的片段，并连接入pGEM-T Easy Vector，然后转染DH5α细菌；参照Omega质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，进行测序分析。

1.4RT-PCR及核酸凝胶电泳分析

RNA样品用promega公司的反转录试剂盒A5001分两步法获得cDNA。取模板cDNA 1 μL，进行PCR反应，加入Sox30基因上、下游引物各1 μL，β-actin内参基因上、下游引物各1 μL，加入TaqDNA聚合酶进行扩增。引物序列为Sox30-F: 5-TTTTTTTTATGGAGAGAGTTAGGT-3; Sox30-R: 5-AAAACAACAACA ACACCTATTCC-3; β-Actin-F: 5-GGAGATTACTGCTGGCTCCTA-3; β-Actin-R: 5-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3。扩增条件: 95℃ 3 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 5 min。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分析。

2结果

2.1Sox30基因只在成年大鼠睾丸组织中高表达

为了确定Sox30在成年大鼠各组织中的表达情况，作者提取了成年大鼠的16种器官组织的RNA，并进行RT-PCR及核酸凝胶电泳分析。结果表明，在成年大鼠中，Sox30仅在睾丸中高表达，在血液中有少量表达，而在卵巢、子宫、附睾、脑、心、肝、肾、脾、胰、肺、垂体、肠、肌肉、海马中呈现不表达或极少表达(图1)。

图1 Sox30基因在成年大鼠各种组织中的表达分析

2.2Sox30基因随睾丸发育表达逐渐增强

作者随后对整个胚胎发育过程中性腺组织Sox30的表达情况进行了检测。结果显示，在E8.5(8.5 d胚胎)，E10.5，E12.5，E15.5和E19.5，Sox30处于低量表达状态；在1D(产后1 d)，4D，7D，10D，15D，20D，40D，60D和73D的卵巢中Sox30处于低量表达或不表达状态；而在1D，4D，7D，10D，15D，20D，40D，60D和73D的睾丸中Sox30处于高表达状态，而且随着发育的进行其表达量持续性升高直到大鼠成年，表明Sox30与大鼠雄性性腺的发育和功能密切相关(图2)。

(E:胚胎期,d:日龄,♂雄性,♀雌性)图2 Sox30基因在大鼠发育不同阶段的性腺中的表达分析

2.3Sox30在成年大鼠各组织的表达受DNA甲基化调控

为了证明Sox30基因在大鼠各组织中的表达与否和其DNA甲基化有关，作者通过BSP直接测序的方法对成年大鼠中典型一对组织睾丸和卵巢及胚胎时期性腺组织的Sox30基因甲基化状态进行了检测。实验结果表明，Sox30在胚胎时期的性腺组织中一直呈高甲基化状态，这与之前所测得的Sox30的表达水平吻合。Sox30在大鼠睾丸组织中甲基化程度随着发育睾丸的发育程度而降低，在大鼠成熟时达到最低(73 d); 而在卵巢组织发育过程中却呈现持续高甲基化。该结果表明，Sox30基因在成年大鼠各组织中的表达受到DNA甲基化的调控(图3)。

3讨论

人和小鼠的不同细胞和组织器官中的SOX家族表达研究显示，该基因表达具有组织和时间特异性，其胚胎发育不同时期的表达和突变分析研究还显示，该基因在神经系统和胚胎发育过程中起到很重要的作用，因此SOX 基因家族成员的研究对于揭示性别决定的分子机制、参与胚胎发育的基因的调控等都有十分重要的意义[4-6]。

作者前期研究发现，Sox30基因在成年小鼠中，仅表达于睾丸组织，推测其可能与雄性发育和睾丸正常功能有关。为了进一步证实这种推测，作者分析了该基因在大鼠发育过程及成年不同组织中的表达情况。结果发现, Sox30基因在成年大鼠中除睾丸外，其他组织中呈低表达或不表达。Sox30基因在大鼠胚胎发育的第10.5～12.5天有一定的表达，而这一时间段恰好是性别决定的关键时期，结合后期Sox30在睾丸中表达一直上调到成年个体表达达到最高值的数据，作者不难推测Sox30基因可能在胚胎发育早期参与了雄性性别的决定，而成年个体中则参与了睾丸功能的正常执行。

(实心圆,表示该CpG位点甲基化;空心圆,表示该位点未甲基化)图3 Sox30基因在成年大鼠组织和发育不同阶段性腺组织DNA甲基化分析

大量的研究[7]表明，DNA甲基化在发育过程中起着关键的调控作用。作者前期的相关研究也表明，不管是在小鼠胚胎发育和成年组织中，Sox30基因表达均受甲基化调控。作者分析了大鼠胚胎不同时期及成年组织中Sox30基因启动子区域甲基化情况，发现睾丸中Sox30呈低甲基化

或非甲基化状态，且甲基化程度随着睾丸的成熟而降低；在胚胎发育早期、卵巢、子宫和成年其它组织中Sox30呈高甲基化状态，这都提示Sox30启动子区域甲基化状态的调控参与了维持睾丸的正常功能。有一点值得注意的是，在胚胎发育早期，Sox30有一定的表达，但是甲基化分析发现其高甲基化，这可能是由于早期胚胎中，多数细胞中该基因不表达，而仅有雄性生殖器官发生相关的细胞中该基因高表达，这一部分细胞比较少，因此甲基化分析时检测出的5个样本均为高甲基化。

总之，在成年大鼠的各个组织器官及胚胎发育过程中，Sox30基因的表达受其启动子区域甲基化调控，Sox30的高表达于成年大鼠睾丸，说明其可能与睾丸的发育和功能调节相关，是一个值得深入研究的基因。

参考文献

[1]Jiang T, Hou CC, She ZY, et al. The SOX gene family: function and regulation in testis determination and male fertility maintenance[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(3): 2187. doi: 10. 1007/s11033-012-2279-3.

[2]Osaki E1, Nishina Y, Inazawa J, et al. Identification of a novel Sry-related gene and its germ cell-specific expression[J]. Nucleic Acids Res, 1999, 27(12): 2503.

[3]Han F, Dong Y, Liu W, et al. Epigenetic regulation of Sox30 is associated with testis development in mice[J]. PLoS One, 2014, 9(5): e97203.

[4]Koopman P, Munsterberg A, Capel B. Expression of a candidate sex determining gene cloning mouse testis differentiation[J]. Nature, 1990, 348: 140.

[5]Shiota K, Yanagimachi R. Epigenetics by DNA methylation for development of normal and cloned animals[J]. Differentiation, 2002, 69: 162.

[6]常重杰, 杜启艳, 邵红伟. Sox基因家族研究的新进展[J]. 遗传, 2002(4): 470.

[7]Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic reprogramming in mammalian development[J]. Science, 2001, 293(5532): 1089.

Study on DNA methylation and expression of Sox30 in the development of rat testis

MA Xuexiang, DONG Yan, HAN Fei, LI Xiaona, SHI Xiaoyan,CHEN Hongqiang, HAO Xianglin, LIU Jinyi

(InstituteofToxicology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400038)

ABSTRACT：ObjectiveTo analyze DNA methylation and expression of Sox30 in embryonic development and sex gland of rats．MethodsThe rat embryos from E8.5 to E19.5, tissues of main organ and sex gland in rats from birth to 73 days were collected．The DNA methylation and expression of Sox30 gene were detected by sodium bisulfite DNA sequencing (BSP) and RT-PCR．ResultsSox30 expression was able to detect in embryos at 10.5 days．The expression of Sox30 increased in the rat testis from birth to early adulthood, while it was not observed in ovary and uterus．Sox30 was low expression or non-expression in ovary, heart, brain, liver, kidney, spleen, pancreas, muscle, intestine, pituitary gland, blood and hippocampus of adult rats．Sox30 expression was regulated by methylation, and methylation of Sox30 was highly expressed in tissues with low expression or non-expression．ConclusionThe tissue-specific expression of Sox30 is associated with its methylation in rats．The stage-specific expression of Sox30 is correlated with its methylation and plays an important role in testis development and gonad function．

KEYWORDS:Sox30 gene；DNA methylation；testis

通信作者:刘晋祎

基金项目:国家自然科学基金项目(81172714)

收稿日期:2015-08-05

中图分类号:R 339.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)01-005-03

DOI:10.7619/jcmp.201601002