NKG2D-IL-21融合基因修饰的结肠癌细胞体外刺激NK细胞活化的研究

赵培蕾, 赵艺杰, 冷　洁, 龚卫娟

(扬州大学医学院 免疫学教研室, 江苏 扬州, 225001)



NKG2D-IL-21融合基因修饰的结肠癌细胞体外刺激NK细胞活化的研究

赵培蕾, 赵艺杰, 冷洁, 龚卫娟

(扬州大学医学院 免疫学教研室, 江苏 扬州, 225001)

摘要:目的观察含NKG2D-IL-21融合基因的重组表达载体转染结肠癌细胞后对NK细胞活化的影响。方法首先利用DNA限制性内切酶鉴定插入真核表达载体(pcDNA3.1-NKG2D-IL-21)的NKG2D和IL-21基因序列，并通过脂质体介导质粒转染结肠癌细胞株CT-26。流式细胞术胞内染色法检测CT-26内NKG2D-IL-21融合蛋白的表达，酶联免疫吸附实验鉴定细胞培养上清NKG2D-IL-21蛋白的含量。最后将经基因转染的CT-26细胞与小鼠脾脏NK细胞共培养，流式细胞术检测NK细胞表面活化性受体CD69的表达。结果NKG2D-IL-21融合基因稳定插入pcDNA3.1载体。CT-26细胞经外源性NKG2D-IL-21融合基因转染后，表达含有NKG2D和IL-21的融合蛋白。分泌NKG2D-IL-21融合蛋白的CT-26细胞具有明显促进NK细胞表达CD69的活性。结论重组pcDNA3.1-NKG2D-IL-21真核表达载体可作为一种新型DNA疫苗。

关键词:NKG2D; IL-21; 融合基因; 结肠癌; NK细胞

NKG2D是表达于NK、CD8+T、γδT、NKT细胞表面的一种活化性受体。当NKG2D与其受体结合, 可激活与其偶联的信号转接蛋白DAP10, 从而启动细胞活化信号通路，促进这些淋巴细胞分泌IFN-γ等细胞因子，以及发挥细胞毒性功能[1-2]。NKG2D的配体为主要表达于人肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合体 I类相关抗原A和B(MICA、MICB), 小鼠主要为视黄酸早期诱导转录子(RAE-1)[3-4]。由于免疫选择压力，晚期肿瘤患者体内淋巴细胞表面NKG2D的表达明显降低，从而不能介导NK细胞等的免疫监视作用[5-6]。IL-21主要由活化的T细胞和NK细胞分泌，IL-21与其受体结合后，激活胞内的JAK1、JAK3和STAT3激酶，从而促进淋巴细胞分泌颗粒酶、IFN-γ，显著增强淋巴细胞的杀伤功能[7-8]。本研究观察课题组前期制备的含NKG2D和IL-21融合基因的表达载体(pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21)转染结肠癌细胞后，是否具有激活NK细胞的功能，从而为制备含该重组表达载体的抗肿瘤基因疫苗提供重要实验依据。

扬州市-扬州大学合作基金(2012038-5); 国家级大学生创新创业训练计划(2013111117045Z)

1材料与方法

1.1实验材料

重组真核表达载体pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21为本课题组前期制备并常规保存，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。DNA限制性内切酶购自Takara公司，质粒抽提试剂盒来自Qiagen公司。小鼠NKG2D抗体(CX5)、CD49b抗体(DX5)、CD69抗体(H1.2F3)，流式胞内染色破膜试剂盒、IL-21检测ELISA试剂盒购自eBioscience公司。重组小鼠IL-21蛋白来自Peprotec公司，RPMI-1640培养基购自Invitrogen 公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。CT-26细胞株来自美国ATCC公司，Balb/c小鼠来自扬州大学比较医学中心。

1.2方法

1.2.1双酶切鉴定重组载体pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21: 含重组质粒的细菌经过夜培养后，利用Qiagen公司小量质粒提取试剂盒，按说明书抽提质粒，紫外分光光度计法测定质粒的浓度。在20 μL总体系中，分别加入Xba I和Kpn I、Xba I和Xho I、Xho I和Kpn I DNA限制性内切酶，37 ℃孵育4 h, 进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.2脂质体包裹质粒后转染细胞：调整重组DNA质粒的浓度为 1 mg/mL, 与脂质体按质量/体积比为6︰1室温孵育20 min。同时对隔夜接种的CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞株)用无血清培养基洗涤3次，加入脂质体质粒混合物，37 ℃孵育5 h后，更换为全血清培养基。72 h后同时收集细胞和培养上清。

1.2.3流式细胞术胞内染色法检测融合蛋白：收集经脂质体转染的CT-26细胞，经冷PBS洗涤后，加入固定/破膜剂，室温孵育30 min收集细胞，破膜缓冲液洗涤细胞，加入以破膜缓冲液稀释的NKG2D抗体(10 μg/mL)，4 ℃孵育30 min, 破膜缓冲液洗涤3次后，利用流式细胞仪(FACS Calibur)检测阳性细胞的频率。

1.2.4ELISA检测细胞培养上清融合蛋白：取预先包被好抗体的酶标板，分别加入上述经脂质体转染的细胞培养上清，37 ℃孵育30 min, 洗涤后加入酶标抗体和底物，37℃避光孵育1 h，加入终止液。15 min后利用酶标仪读取450 nm处吸光度值。根据阳性蛋白对照绘制标准曲线，计算各样品内NKG2D-IL-21的浓度。

1.2.5基因修饰的CT-26细胞对NK细胞的刺激：按1.2.2方法转染CT-26细胞，48 h后分离正常小鼠脾脏单细胞悬液，按1︰1细胞数比例共培养过夜。次日收集细胞，经冷PBS洗涤后，同时加入CD49b抗体(DX5，标记小鼠NK细胞)和CD69抗体，流式细胞仪检测DX5+CD69+细胞的频率。

1.3统计学分析

不同处理组之间的差异采取ANOVA分析方法，两组之间的比较采取团体t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1重组pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21表达载体

的酶切鉴定

为明确课题组先前制备的2个NKG2D胞外区和IL-21基因序列均插入真核表达载体pcDNA3.1(-)，分别利用Xba I和Kpn I、Xba I和Xho I、Xho I和Kpn I DNA限制性内切酶处理重组载体。结果证实，在Xba I和Xho I酶切位点之间插入了第1个NKG2D基因序列(544 bp)，在Xho I和Kpn I酶切位点之间插入了第2个NKG2D和IL-21基因序列(858 bp)，而在Xba I和Kpn I酶切位点之间则包含了2个NKG2D和IL-21的基因序列(1402 bp)，其电泳结果见图1。

2.2重组质粒转染CT-26细胞后融合蛋白表达的鉴定

脂质体包裹重组质粒后，体外转染对数期培养的CT-26细胞，72 h后收集细胞，流式细胞仪胞内染色法检测NKG2D-IL-21融合蛋白的表达。结果证实，重组质粒转染细胞后，NKG2D-IL-21融合蛋白得到表达(图2)，且随着转染质粒浓度的增加，NKG2D-IL-21融合蛋白阳性表达的细胞频率明显增高(图3)。

1.pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21载体经XbaI和KpnI酶切2.pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21载体经XhoI和KpnI酶切3.pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21载体经XbaI和XhoI酶切4.DNAladder图1 重组载体pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21双酶切后产物的凝胶电泳结果

图2 流式细胞仪胞内染色法检测CT-26细胞表达的融合蛋白NKG2D-IL-21

与空质粒相比,**P<0.01;与空质粒相比,***P<0.001。图3 不同剂量重组质粒转染CT-26细胞后,NKG2D阳性细胞频率的比较

2.3重组质粒转染CT-26细胞，培养上清内融合蛋白浓度的测定

收集经重组质粒转染的细胞培养上清，ELISA检测上清内IL-21的浓度。结果显示，重组质粒转染细胞后，NKG2D-IL-21融合蛋白可分泌细胞外，且随着转染质粒浓度的增加，NKG2D-IL-21融合蛋白阳性表达的细胞频率明显增高(图4)。

与空质粒相比,*P<0.05;与空质粒相比,**P<0.01。图4 不同剂量重组质粒转染CT-26细胞后,培养上清NKG2D-IL-21融合蛋白的浓度

2.4重组质粒转染的CT-26细胞对NK细胞的刺激

CT-26细胞经重组质粒转染后，与脾脏单细胞悬液孵育后，检测NK细胞表面CD69的表达。结果发现，与商品化重组IL-21蛋白相似，经重组质粒转染的CT-26细胞可明显促进NK细胞表达CD69(图5、6)。

图5 重组质粒转染CT-26细胞后,刺激NK细胞表达CD69的检测

与空质粒相比,**P<0.01。图6 经重组质粒转染的CT-26细胞刺激NK细胞表达CD69的统计学分析

3讨论

本研究首先对课题组先前制备的重组pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21载体进行表达特性分析，在证实该重组载体转染结肠癌CT-26细胞后，可在胞浆和细胞培养上清检测到NKG2D-IL-21融合蛋白的表达和分泌；并进一步观察到经该融合基因修饰的CT-26细胞可刺激脾脏NK细胞活化，证明该重组基因表达的产物具有生物学活性。研究结果不仅从细胞层面证实该重组真核表达载体的有效性，还为进一步开发相应的基因疫苗、或基因修饰的肿瘤疫苗，用于临床治疗提供实验依据。

NKG2D识别其配体MICA分子时，是由2个NKG2D同源二聚体形成复合物来结合1个MICA分子[9]，因此本研究制备的NKG2D-IL-21融合基因中含有2个NKG2D胞外结构域序列，将保证该基因的表达产物NKG2D-IL-21蛋白对其配体的结合功能。课题组前期利用重组DNA技术，在大肠杆菌表达NKG2D-IL-15融合蛋白，体内外实验[10]均证实该蛋白具有很强的识别MICA/RAE-1阳性肿瘤细胞的活性。本文中制备的NKG2D-IL-21重组载体与NKG2D-IL-15相比，并未改变上游NKG2D的基因序列，因此理论上同样具有较好的识别相应肿瘤细胞的活性。

尽管IL-21在体内主要由活化的CD4+T和NKT细胞分泌，其受体在体内广泛表达，如T、B、NK、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤及肠道上皮细胞[11]。IL-21可促进CD4+T细胞向Th2、Th17细胞分化，抑制调节性Treg细胞的分化，并促进B细胞的类别转换，被认为是滤泡辅助性T细胞发挥活性的关键细胞因子[12]。IL-21信号通路活化后可明显刺激NK和CD8+T细胞发挥细胞毒功能，促进颗粒酶和FasL的表达[13]。胰腺癌[14]和乳腺癌[15]细胞过表达IL-21分子，均可明显抑制肿瘤的生长。外源性添加重组IL-21蛋白可明显抑制小鼠肿瘤的生长，且与IL-2和IL-15相比，具有明显的优越性[16]。结肠癌细胞经外源性NKG2D-IL-21融合基因修饰，刺激NK细胞活化后，是否发挥抗肿瘤活性，还期待进一步研究。

综上所述，本研究将重组pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-21载体转染结肠癌细胞进行基因修饰后，证明该细胞直接具有刺激NK细胞活化的能力，为后续研发相应的肿瘤治疗性IL-21基因疫苗以及表达IL-21相关基因工程蛋白，建立重要的前期工作基础。

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Study of NK cell activation by colon cancer cells genetically modified with NKG2D-IL-21 fusion gene ex vivo

ZHAO Peilei, ZHAO Yijie, LENG Jie, GONG Weijuan

(TeacjimgandResearchSectionofImmunology,MedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe effect of NK cell activation by colon cancer cell genetically modified with NKG2D-IL-21 fusion gene in a recombinant expression vector. MethodsFirstly, the recombinant vector, pcDNA3.1-NKG2D-IL-21, was identified with double restrictive enzymes for insertion of NKG2D and IL-21. After transfection by liposome and plasmid complex, expression of NKG2D-IL-21 fusion protein in CT-26 cells (a colon cancer cell line) was detected by an intracellular staining flow cytometry. Concentrations of NKG2D-IL-21 in cell-culture supernatants were measured by an ELISA assay. Finally, transfected CT-26 cells were co-cultured with mouse splenocytes overnight, and frequencies of DX5+CD69+cells were checked by flow cytometry. ResultsThe NKG2D-IL-21 fusion gene was stably inserted into pcDNA3.1. Ectopically transfection by NKG2D-IL-21 fusion gene in CT-26 cells leaded to express the corresponding protein. The secreted protein by CT-26 cells pre-transfected by the pcDNA3.1-NKG2D-IL-21 plasmid stimulated NK cells to express CD69. ConclusionThe pcDNA3.1-NKG2D-IL-21 plasmid can be considered as a new DNA vaccine to mediate anti-tumor activity.

KEYWORDS:NKG2D; IL-21; fusion gene; colon cancer; NK cell

通信作者:龚卫娟

基金项目:国家自然科学基金(81471547, 81172785); 江苏省自然科学基金(BK2011449, BK2008215);

收稿日期:2015-09-10

中图分类号:R 392.33

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)01-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201601001