粪便中miRNA-424在结直肠癌诊断和筛查中的应用

许安东, 朱云祥, , 汤晓飞, 王光辉

(1. 扬州大学第二临床医学院 普外科, 江苏 扬州, 225000;

2. 上海交通大学附属新华医院 结直肠外科, 上海，200092)



粪便中miRNA-424在结直肠癌诊断和筛查中的应用

许安东1, 朱云祥1, 2, 汤晓飞1, 王光辉2

(1. 扬州大学第二临床医学院 普外科, 江苏 扬州, 225000;

2. 上海交通大学附属新华医院 结直肠外科, 上海，200092)

摘要:目的研究miRNA(miR-150, miR-424，miR-29b，miR-96)在结直肠癌组织和粪便中的表达情况。方法纳入77例结直肠癌患者以及43名正常志愿者。运用实时定量PCR技术，对miRNA在结直肠癌患者与正常人群的粪便中的表达情况进行检测，并比较二者的差异。结果 miR-150在正常人群和结直肠癌患者粪便中表达有显著差异(P<0.05); miR-424在正常组中的表达量显著低于肿瘤组(P<0.05)。miR-29b和miR-96在两种人群粪便中的表达量无显著差异(P>0.05)。miR-424的曲线下面积为0.756，而miR-150的曲线下面积为0.661。结论miR-424在结直肠癌患者和正常人群的粪便中表达存在明显差异。

关键词:microRNA; 结直肠癌; 肿瘤标志; 诊断

结直肠癌作为世界上最常见的3种恶性肿瘤之一，也是肿瘤相关性死亡的主要原因[1]。尽管结直肠癌根治术已经大大降低肿瘤的死亡率，但是肿瘤的晚期转移和复发仍然是患者死亡的主要原因。结直肠癌早期症状不明显，患者诊断肿瘤往往已是中晚期，延误了肿瘤的治疗[2]。所以早期筛查和诊断是降低结直肠肿瘤死亡率和提高患者预后的重要措施[3]。

目前已有一些检验方法和蛋白标记物用于检测早期结直肠癌，如粪便隐血试验、癌胚抗原(CEA)、CA125、CA19-9等。但是这类检验方法以及蛋白标记物的敏感性不强，无法达到检测早期肿瘤的目的[4-5]。结肠镜和病理检查是当前诊断结直肠癌的金标准，根据临床指南，其适用于50岁甚至更高年龄的人群[6]。由于结直肠镜检查前需要做肠道准备，可能会造成被检者的不适，以及费用较高等因素，并没有在发展中国家得到广泛的使用[7-8]。影像学检查如CT和MRI都是非常有效和非侵入性的检查，但是辐射、高费用以及对早期肠道肿瘤的检出率低影响了其在筛查结直肠癌中的应用[9]。

MicroRNA是一类由18～25个核苷酸组成的非编码RNA家族，参与调控近1/3的人类基因，影响细胞的增殖、迁徙、转移、凋亡等功能。它的异常表达在多种肿瘤中得到证实，包括结直肠癌[10-11]。Ahmed等[12]在5位正常志愿者和15位肠癌患者的粪便中发现，miR-21、miR-203、miR-20a、miR-326、miR-92等在肿瘤患者的粪便中表达上调，而miR-320、miR-126、miR-484-5p、miR-145、miR-16、miR-125b等则相反。在作者前期的筛查中发现，miR-150在正常组织中的表达量比肿瘤组织高，而miR-106b，miR-96和miR-424在肿瘤组织中的表达相对于正常组织明显升高[13]。由此作者设想，粪便中这4种miRNA在肿瘤患者和正常人群粪便中的表达量可能存在差异，并且有望成为一类非侵入性肿瘤标记物来筛查和诊断结直肠癌。

1材料与方法

1.1粪便标本

本次研究中，作者纳入了新华医院结直肠癌诊治中心77例结直肠癌患者以及43例正常志愿者，收集其粪便标本。排除患有炎症性肠病、腹泻、肠道功能紊乱以及曾接受过肠道手术、放化疗的患者。本实验通过了新华医院伦理委员会，每位参与者都签订了知情同意书。

1.2总RNA的提取及RT-PCR

使用Omega 粪便RNA提取试剂盒(R6828-01)提取所有参与试验的志愿者粪便中的总RNA, 用Biotend试剂盒进行一步法荧光定量PCR, 引物序列为hsa-miR-150: UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG；hsa-miR-29b: GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA；hsa-miR-96: UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU; hsa-miR-424：CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA。U6选作该实验的内参，引物均由上海拓然生物公司合成，采用相对表达量评估基因表达水平，采用2-△△Ct法计算。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件，运用非参数独立样本t检验对比miRNA的表达差异,P<0.05为差异有统计学意义；图表均使用Graphpad 5.0制作。

2结果

采用荧光定量PCR对所有参与该实验的120例志愿者粪便中miRNA相对表达量进行分析，包括77例肿瘤患者和43例正常志愿者。肿瘤患者中男40例，女37例；年龄<60岁53例，≥60岁24例；直肠癌36例，结肠癌41例；患者优8例，良67例，差2例；肿瘤大小为≤3 cm者25例，3～5 cm者23例，≥5 cm者29例；肿瘤分期T1者3例，T2者15例，T3者40例，T4者19例；淋巴转移N0者26例，N1者30例，N2者21例；远处转移M0者64例，M1者13例；疾病分期Ⅰ级11例，Ⅱ级13例，Ⅲ级41例，Ⅳ级13例。

作者发现miR-150在肿瘤患者粪便中的表达量明显要低于正常志愿者(P<0.05), miR-424在肿瘤患者粪便中的表达量相对于正常志愿者明显升高(P<0.05), 但是miR-29b和miR-96在肿瘤患者和正常志愿者粪便中的表达无显著差异(P>0.05)。见图1。

运用ROC曲线法进一步分析数据发现, miR-424和miR-150的曲线下面积(AUC)为0.756(标准误为0.047,P<0.001)和0.661(标准误为0.049,P=0.001)。另外, miR-424对结直肠癌的诊断具有69.94%的敏感性和74.42%的特异性，而miR-150的特异性和敏感性为72.5%和54.5。见图2。

3讨论

结直肠肿瘤是全世界最常见的肿瘤之一，其发病机制尚不完全清除，目前最有效的治疗还依赖于结直肠肿瘤切除[14-18]。尽管根治性切除已经大大降低了结直肠癌的死亡率，但是晚期的复发与转移依旧是肿瘤患者死亡的主要原因[19-21]。由于结直肠癌早期症状不明显，往往使得很多患者失去了早期治疗的机会，所以早期诊断成了预防和治愈结直肠癌的重要环节[22-24]。

目前许多检查如血清指标、肠镜检查以及一些先进的影像学检查，由于准确率不高，敏感性不强以及价格较昂贵等原因，不适用于早期结直肠癌的筛查和诊断[24-26]。另外一些分子生物指标出现，并有望用于结直肠癌的早期诊断，例如血清中miRNA等也起到了预测结直肠癌的目的，但是血清中这类指标稳定性较差。相比较而言，粪便中的miRNA的稳定性和提取难易程度要优化很多[25]。

A: miR-150在CRC患者粪便中表达量明显比正常志愿者低; B: miR-424在CRC患者粪便中表达量明显比正常志愿者高；

图2miR-150和miR-424的ROC曲线分析

关于miRNA作为生物指标预测结直肠癌的相关报道并不是很全面。有研究[26]通过检测粪便中miRNA发现，miR-135b在正常志愿者、腺瘤以及结直肠癌患者粪便中的表达量呈现递增趋势。miR-150具有抑制结直肠肿瘤生长的作用，其表达下调与结直肠肿瘤的发生发展息息相关[27], miR-424具有促进结直肠癌肿瘤发生发展的作用[28]。本研究结果显示，miR-150在结直肠癌患者粪便中的表达量明显比正常志愿者低，而miR-29b和miR-96在二者粪便中的表达量无显著差异。另外运用曲线下面积(AUC)分析miR-150和miR-424对结直肠癌的预测效果发现，二者的曲线下面积分别为0.756和0.661，miR-424对结直肠癌诊断的敏感性为69.94%，特异性为74.42%，而miR-150的特异性和敏感性为72.5%和54.5。AUC>0.5时，AUC越靠近1, 诊断效果越好。AUC在 0.5～0.7时准确性较低，AUC在0.7以上时准确性较好。

通过本次实验作者发现，miR-424在结直肠癌患者粪便中的表达量相比于正常患者上调明显，与肿瘤组织中miR-424表达高于正常组织的趋势一致，证明miR-424有望成为结直肠癌早期筛查和诊断的肿瘤标志物。由于miR-150对结直肠癌的诊断准确性较低，不适用于早期诊断和筛查。

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Application of fecal miRNA-424 in screening and diagnosis of colorectal cancer

XU Andong1, ZHU Yunxiang1, 2, TANG Xiaofei1, WANG Guanghui2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondSchoolofClinicalMedicineofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001; 2.DepartmentofColorectalSurgery,XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200092)

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the expressions of miRNA (miR-150, miR-424, miR-29b, miR-96) in the tissues of colorectal cancer (CAC) and feces. MethodsA total of 77 patients with CRC and 43 healthy volunteers were selected, and the real-time PCR method was used to evaluate the miRNA expression in the feces of the patients with CAC and healthy volunteers. ResultsSignificant difference of the miR-150 expression was found between the feces of patients with CRC and healthy volunteers (P<0.05), and miR-424 expression in the normal group was significantly lower than the tumor group (P<0.05). There were no significant differences in expressions of miR-29b and miR-96 between the patients with CAC and healthy volunteers (P>0.05). The area under the curve (AUC) of miR-424 was 0.756, and 0.661 for miR-150. ConclusionThere is significant difference of miR-424 expression between the feces of the patients with CAC and healthy volunteers.

KEYWORDS:microRNA; colorectal cancer; biomarker; diagnosis.

通信作者:朱云祥

基金项目:中国博士后科学基金面上资助项目(2012M510859)

收稿日期:2015-10-23

中图分类号:R 735.3

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)01-016-04

DOI:10.7619/jcmp.201601005