细菌介导的肿瘤治疗研究进展

柳贤德，姜圣男

(1.海南大学农学院动物医学专业，海南海口 570228；2.海口市人民医院核医学科，海南海口 570208)



细菌介导的肿瘤治疗研究进展

柳贤德1，姜圣男2*

(1.海南大学农学院动物医学专业，海南海口 570228；2.海口市人民医院核医学科，海南海口 570208)

虽然针对肿瘤治疗的化学合成药物、天然提取物、基因工程药物和靶向性药物得到了快速发展，但还达不到治疗肿瘤的效果。一些细菌，尤其是厌氧或兼性厌氧菌可在肿瘤组织内定殖，而且有效抑制肿瘤的生长。随着生物技术的发展，人们改造了一系列厌氧或兼性厌氧菌，降低其毒性的同时，利用肿瘤靶向定殖的能力，使之作为携带治疗分子的载体，为肿瘤治疗提供了新的方向。如果细菌介导肿瘤治疗，以宠物临床应用为目的，做进一步深入研究，可为宠物肿瘤提供更理想的治疗方案。

细菌；肿瘤；宠物临床

肿瘤是当今难以治愈，危害人和动物健康及生命的重要疾病。传统的肿瘤治疗方法主要有手术、放疗和化疗。肿瘤治疗过程中，手术疗法很难完全清除肿瘤细胞，作为有效的辅助疗法，放射疗法和化学疗法成为了肿瘤治疗学的支柱。但是，很多病例中不管是放疗，还是化疗，都很难完全杀死肿瘤细胞，而且还可能引发细胞毒性、肿瘤细胞耐药性、机体免疫力低下等问题。这主要是因为放疗和化疗的药物达不到肿瘤的缺氧区域而引起的。低氧区域的存在是实体瘤的一大特性，这是由于伴随着肿瘤的生长，会刺激肿瘤内新血管的产生。肿瘤中混乱的新成血管分布，未完全发育的血管内皮，不完善的封闭段，紊乱的血液循环等因素，导致肿瘤内血液流动缓慢而致使肿瘤组织内氧气和营养物质传递低效，从而形成了一个低氧(氧含量小于10 mL/L或0～2.66 kPa,正常组织氧含量约为30 mL/L～50 mL/L，2.66 kPa～13.3 kPa)或缺氧的区域，而且处于低氧的肿瘤细胞会促进其向恶性或转移的方向发展。放疗过程中，氧具有极其重要的决定性作用，处于低氧的细胞对电离辐射的抵抗率是正常细胞的3倍以上；化疗过程中，因肿瘤内血管分布紊乱和化疗药物的传递低效，导致耐药性肿瘤细胞的产生[1-2]。因此，适合在缺氧区域定殖的细菌作为载体的靶向肿瘤治疗方法，越来越受到很多研究者的关注[3-4]。本文将对细菌介导肿瘤治疗进行系统的阐述，为其应用在犬肿瘤治疗上提供参考。

1　细菌介导肿瘤治疗

多年以前，人们就已经开始尝试用细菌进行肿瘤治疗，Coley W B发现，癌症病人手术后如果感染了细菌，其治愈率有所提高；且目前临床上手术摘除膀胱癌后，常会注射一种预防肺结核的疫苗BCG，以降低复发率[5]。细菌抑制肿瘤生长的主要机制并不明确，但也有相应的几种解释：①细菌消耗了肿瘤生长所需的营养物质，如其产生的天冬酰胺酶能够分解肿瘤生长的必需氨基酸；②细菌能够产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及分泌局部毒素，破坏或抑制肿瘤正常血管的形成[6-7]；③在细菌的定殖区域，其非特异性炎症反应可促使免疫系统潜在激活抗肿瘤T细胞[8]。

细菌具有很多优势，使其作为“完美的载体”很好地应用于抗癌治疗：①细菌像小型“机器人”，可携带成像探针特异性靶标到肿瘤细胞，为我们提供有关肿瘤状态、定位的成功率以及治疗效果等精确信息[9]；②细菌可携带抗肿瘤药物靶标到肿瘤细胞，而且分散于整个肿瘤组织并有很强的逆行肿瘤的能力，可大大提高治疗性分子的传递效率[10]；③细菌对肿瘤的特异性靶向作用，提高治疗效率及减少对正常组织的损害。

1.1细菌的肿瘤靶向

细菌之所以能成为一种新的抗肿瘤治疗策略的载体，靶向肿瘤并且可定殖于肿瘤的低氧区域有着密不可分的关系。细菌靶向肿瘤的机理也不明确，但也有相应的几种解释[11]：①由于肿瘤中紊乱的血管系统造成氧及营养物质传递低效，这为厌氧菌或兼性厌氧菌的定殖提供了有利条件；②在低氧的环境下，肿瘤部位分泌的肿瘤生长因子β(TGF-β)可以抑制中性粒细胞的激活和浸润，使巨噬细胞和中性粒细胞的杀菌活性受损；③由于肿瘤内部氧含量低且间质压大，细菌不容易暴露在抗体下，在一定程度上逃避小鼠免疫系统。

1.2肿瘤治疗用细菌载体

目前发现有多种细菌可应用于抗肿瘤治疗，如双歧杆菌(Bifidobacterium),梭菌(Clostridum)及沙门菌(Salmonella)等。相比外围的肿瘤增生组织，兼性厌氧菌(如减毒沙门菌和大肠埃希菌)更倾向定殖于低氧和坏死区域，而且对实体肿瘤的低氧区域进行准确的靶向定位[12-14]。

1.2.1大肠埃希菌大肠埃希菌属非厌氧益生菌，易于培养和体外基因操作，被广泛用于体外基因表达的载体。由于大肠埃希菌为正常菌群，且主要在盲肠及结肠生长，其作为消化道肿瘤基因治疗载体的潜力受到广泛关注[15]。大肠埃希菌Nissle1917的肿瘤靶向性最高，它能在小鼠的肿瘤部位聚集，且不被免疫系统清楚，而且可携带外来基因(如GFP)，不影响消化道中的黏附及定殖。大肠埃希菌Nissle1917通过口服可治疗腹泻、溃疡性结肠炎、克罗恩肠炎等消化道疾病，显示其安全性和有效性，证明了治疗肿瘤用作治疗载体的可行性[16-18]。Jiang S N等[6]利用大肠埃希菌MG1655作为肿瘤治疗载体并携带治疗性分子细胞溶素蛋白(ClyA，是一种在大肠埃希菌、伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌中被发现的34 kb大小的成孔溶血蛋白，它通过组装成环形毒素低聚物以在细胞膜表面形成稳定的孔洞)通过尾静脉注射到小鼠结肠癌模型。大肠埃希菌MG1655- ClyA显著抑制肿瘤的生长，而且与放疗协同治疗时，肿瘤部分或完全根除。

1.2.2沙门菌1997年，耶鲁大学的Pawelek J M等[19]首次系统地研究了减毒沙门菌的直接抗瘤活性及其作为靶向治疗载体的可能性，发现高侵袭力、营养缺陷型沙门菌具有直接的抗肿瘤活性，并具有靶向治疗载体的很多优点。减毒鼠伤寒沙门菌VNP20009注射到多种移植瘤小鼠模型(鼠结肠癌、鼠乳腺癌、鼠肺癌、人黑色素瘤、人结肠癌)，发现具有良好的靶向性，而且动物的生存时间也得到了延长。利用猴子观察了该菌的分布情况，发现主要分布在肝、脾、淋巴结、骨髓等组织中，30 d后只有肝能检测到细菌[20-21]。缺少鸟嘌呤核苷5′-二磷酸-3′-二磷酸鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium， ΔppGpp)也是减毒沙门菌。Jiang S N等[9]将携带ClyA的沙门菌ΔppGpp注射到移植瘤小鼠模型(鼠结肠癌和肝癌模型)，有效抑制肿瘤的生长，并且延长了动物的生存时间。沙门菌ΔppGpp在小鼠的肺、肝、脑胶质瘤等肿瘤模型中都表现出很好的肿瘤抑制效果[22-25]。

1.3细菌介导肿瘤治疗存在的问题

细菌介导的肿瘤治疗中，细菌大部分聚集在肿瘤坏死区域，而且宿主的中性粒细胞移入到活肿瘤细胞，像屏障一样包围了肿瘤坏死区域并把肿瘤坏死区域和活肿瘤细胞区域分开，细菌感染而引发的肿瘤坏死区域越大，中性粒细胞的浸润更强。利用抗体消耗小鼠的中性粒细胞，细菌诱导的肿瘤坏死区域显著增大，而且肿瘤中的细菌数量也相应提高[26]。沙门菌ΔppGpp介导的抑制肿瘤生长阶段，沙门菌ΔppGpp在肿瘤中引发IL-1β/TNF-α介导的免疫应答，巨噬细胞主要分泌TNF-α，树突状细胞主要分泌IL-1β[27]，而且TNF-α和IL-1β对抑制肿瘤生长有着积极的作用。系统性的中细粒细胞消耗在临床治疗中是不切实际的，但如果通过细菌的靶向抑制肿瘤组织中性粒细胞的募集，一定能提高细菌的肿瘤治疗效果。

2　犬肿瘤临床治疗

在兽医领域，犬是最易患肿瘤的动物。小动物临床肿瘤的发病率正逐年增多，也是动物死亡的主要病因之一。肿瘤可能会侵袭到动物身体的多个器官和组织。犬肿瘤发生过程中，品种、年龄、性别、遗传基因、环境等因素与肿瘤的发生有密切相关。犬乳腺肿瘤多发于母犬，而公犬少见；多见于老龄犬，少见于幼龄犬。随着城市污染的加剧，有些肿瘤疾病如鼻咽部肿瘤发生的几率城市犬高于乡村犬[28]。刘春晖等[29]调查了北京地区犬肿瘤发生情况，前3位的肿瘤依次是乳腺肿瘤、皮肤肿瘤、肛周瘤、睾丸肿瘤、阴道肿瘤；在发病率前5位的肿瘤中，排名前3位的品种中都有京巴犬；患肿瘤犬的平均年龄为9.36±3.74，除皮肤肿瘤其余4种肿瘤的发病年龄均大于10岁。朱国等[30]调查了杭州地区犬肿瘤发生情况，乳腺和皮肤及软组织是犬肿瘤临床高发的部位；京巴犬、杂交犬、贵宾犬是肿瘤高发品种；平均年龄9.39岁，6岁～10岁发病率最高。

2.1手术疗法

对于犬肿瘤治疗，目前最常用最有效地方法依旧是手术摘除。手术的成功很大程度上取决于动物的身体机能状况及诊断处于早期还是晚期。但是手术切除不彻底，可引起继发感染或肿瘤扩散等风险。

2.2化学疗法

化学疗法是一种化学药物杀死肿瘤细胞的过程，干扰肿瘤细胞DNA的复制、转录、翻译过程，从而诱导细胞的凋亡，达到杀伤肿瘤的目的。但是化疗药物存在毒性较大、损伤机体免疫系统等风险。

2.3放射疗法

放射疗法是用放射线杀灭肿瘤细胞的方法，其多用于对局限性的病灶进行治疗，用于神经组织、软组织、圆形细胞肿瘤等，但也存在伤害机体免疫系统等风险。放射疗法在犬肿瘤方面的应用有限，但手术后的补助治疗手段，前景甚好。

2.4细菌疗法

2005年Douglas及其同事进行了沙门菌VNP20009治疗犬自发性肿瘤的Ⅰ期临床试验，沙门菌VNP20009对部分犬具有抗肿瘤作用，但会产生发热、腹泻和呕吐等不良反应，呈现剂量依赖性毒性作用。Dang L H等[31]也利用诺维梭菌对16例自发性软组织肉瘤犬进行了治疗，有一定的治疗效果，但也伴随着不良反应如发热、炎症、脓肿、食欲不振和嗜睡等。治疗犬自发性肿瘤一般采用静脉注射或瘤内注射的方式，致病和弱毒菌株都呈现不同程度的不良反应[32-33]。因此，选择何种菌株来减少细菌疗法的毒副作用，而且适用于那些肿瘤以及细菌与肿瘤环境之间的相关关系和所涉及的机理等问题，需要进一步研究和阐明。

3　展望

癌症是极其复杂和存在很多未知的疾病，虽然现今有很多治疗方法，但对癌症还是束手无策。尽管在兽医领域对犬乳腺肿瘤的各种治疗方法还存在争议，但进行外科手术几乎是所有患有乳腺肿瘤犬所采取的治疗方法。可能发展成为转移性的犬乳腺肿瘤病例，还可增加化学疗法、激素疗法、放射疗法、中医疗法等综合治疗进行控制。细菌治疗肿瘤的历史已有100多年，随着微生物基因工程技术的发展和研究方法的不断改善，治疗效果和安全性也明显改善。作者正在进行沙门菌ΔppGpp携带各种治疗分子治疗肿瘤的相关研究，最终目标是将其应用在宠物的临床肿瘤治疗。研究的初步结果发现，属伤寒沙门菌ΔppGpp在3×107CFU/kg～3×109CFU/kg范围内，对犬不会产生不良反应，而且对肿瘤细胞活性具有明显的抑制作用。细菌靶向肿瘤治疗具有对正常组织的损伤小、价格便宜、操作简便等优势，如果能应用在国内城市高发的犬乳腺和皮肤肿瘤的治疗，可为宠物肿瘤的临床治疗提供新的思路。细菌靶向肿瘤治疗应用在宠物临床，需要更多的科学研究和临床试验，确保细菌治疗宠物肿瘤的有效性和安全性。

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Progress on Bacteria Mediated Cancer Therapy

LIU Xian-de1,JIANG Sheng-nan2

(1.Department of Veterinary Medicine,Hainan University,Haikou,Hainan,570228,China;2.DepartmentofNuclearMedicine,HaikouPeople'sHospitalHaikou,Hainan,570208,China)

The tumor drugs have been rapidly developed such as chemosyntheses,herbal medicines,and gene therapy in recently,but we could not reach efficiently treatment of cancer.The tumor was colonized and suppressed by anaerobic or facultative anaerobic bacteria.The researcher reduced toxicity of anaerobic or facultative anaerobic bacteria and carried therapeutic molecules using new biotechnology,which provided a new direction for cancer therapy.If bacteria mediated tumor therapy can be used in pet clinicity,may provide new strategy for tumor therapy for dogs.

bacteria;tumor;pet clinic

2016-04-11

海南省应用技术研发与示范推广专项项目 (ZDXM20130067/ZDXM2015065)；海南省社会发展科技专项项目 (SF201421)

柳贤德(1979-)，男，吉林延边人，副教授，博士，主要从事兽医公共卫生学研究。*通讯作者

S854.5

A

1007-5038(2016)09-0099-04