猪流行性腹泻病毒细胞受体研究进展

朱庆贺，苗　艳，张鹏宇，王观悦，陈　曦，王　爽，史同瑞

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161000)



猪流行性腹泻病毒细胞受体研究进展

朱庆贺，苗艳，张鹏宇，王观悦，陈曦，王爽，史同瑞*

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161000)

猪流行性腹泻病毒主要引起仔猪腹泻，发病率及病死率极高，严重影响养猪业的发展。而猪流行性腹泻病毒要感染仔猪,必须与宿主细胞表面的受体结合。目前已有研究证实,猪流行性腹泻病毒的细胞表面受体为猪氨基肽酶N(pAPN)。为了能更好的揭示pAPN在病毒感染过程中的机制，学者针对pAPN的结构、功能以及与病毒的感染结合区域进行了系统的研究，并开展了筛选pAPN结合短肽的工作，以此来探索病毒受体的阻断剂。为进一步研究猪流行性腹泻病毒感染机制及其细胞受体的作用提供参考，论文就目前pAPN最新研究进展进行了综述。

猪流行性腹泻病毒；猪氨基肽酶N；受体

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度传染性的肠道疾病。该病主要以急性肠炎、水样腹泻、呕吐和脱水为特征。各年龄段的猪均可感染，病死率极高。2010年我国南方地区大量仔猪死亡给养猪业造成了严重的经济损失[1-3]。2015年美国也暴发了大规模的PED[4-6]。自此PED引起了全世界学者的广泛关注。针对PEDV研究也越来越深入，一些研究者通过研究PEDV的受体猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)来探索PEDV的感染机制和防控措施。

APN是一种Ⅱ型膜结合金属蛋白酶，存在于机体多种组织中并行使不同的功能，在肝脏、脑、肺以及肠的上皮、内皮、成纤维细胞中都有表达。PEDV主要通过与猪小肠黏膜上皮细胞(IEC)中的pAPN结合感染仔猪[7]。新近的研究证实PEDV也可与北京鸭小肠上皮细胞表达的APN受体结合从而在其上增殖[8]。pAPN作为PEDV侵入细胞的必要结合受体意义重大，但目前对pAPN的相关作用机制、功能区域研究尚处于起步阶段。因此，本文对pAPN的结构和功能的相关研究进展进行了综述，总结了pAPN与PEDV感染有关的研究成果，为进一步揭示pAPN在PEDV感染过程中的相关机制提供参考。

1　PEDV 基因组结构

PEDV属尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒亚科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属成员[9]，其基因组是单股正链具有感染性的RNA，5′端有帽子结构(Cap),3′端有Poly(A)尾，基因组全长28 033 bp，包括主要开放阅读框(ORF) 6个，分别是复制酶多聚蛋白1ab(pp1ab)、纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)基因。其中复制酶多聚蛋白包含ORF1a和ORF1b两个开放阅读框，总长12 354 bp，主要功能是使核糖体进行移码阅读，保证基因的正确翻译。病毒的结构蛋白为S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。其中，E蛋白是由76个氨基酸组成，系位于病毒囊膜上的小包膜蛋白，在病毒的组装和出芽时发挥作用。M蛋白为膜糖蛋白，能介导机体产生α干扰素。N蛋白由441个氨基酸组成，与PEDV的RNA相互缠绕形成核衣壳，其基因结构稳定保守性强，被作为诊断开发的首选[10]。病毒的S蛋白又称纤突蛋白，由1 383个氨基酸组成，在病毒感染的开始阶段，由S蛋白首先与受体(pAPN)结合使病毒进一步感染细胞。因此，S蛋白是研究病毒感染机制的重要蛋白质[11-12]。

PEDV主要感染猪肠道细胞，PEDV的S蛋白与肠上皮细胞上的受体结合后通过膜融合侵入细胞内，脱囊膜或脱壳后，在小肠上皮细胞(IEC)中完成复制、转录及病毒粒子装配。目前西北农林科技大学已经成功建立猪IEC[13]，这对于PEDV感染机制的进一步研究意义重大。

2　氨基肽酶N

2.1氨基肽酶N结构与功能

氨基肽酶(APN)也被称为CD13，是一种膜结合型锌离子依赖性金属蛋白酶，大小约150 ku～160 ku。而pAPN基因cDNA全长2 886 bp，编码961个氨基酸[14]。APN在猪、鼠、人、牛、猫、狗、鸡等动物中氨基酸序列同源性高。二级结构预测分析显示APN分为7个不同的区域。pAPN在仔猪肠道内能被胰蛋白酶切割成B亚基(pAPN-B，主要包括Ⅰ-Ⅵ区)和C亚基(pAPN-C，主要为7区)。B亚基中结构Ⅰ区由7个氨基酸残基组成，位于细胞胞浆内。Ⅱ区为跨膜区域。大约第40-70位氨基酸为Ⅲ区，为柄状区，具有大量的糖基化位点以及大量的脯氨酸。Ⅳ区包含第70-252位氨基酸残基。第253-580位氨基酸残基为Ⅴ区和Ⅵ区，这一区域是APN的酶活性以及锌离子结合位点区。APN的Ⅶ区包含第581-967位氨基酸残基，此区域含有高达4个半胱氨酸残基，而且这些残基并没有与其他区域形成二硫键[15]， 研究人员推测Ⅶ区可能为PEDV与pAPN的主要结合区域。

APN功能复杂，在不同机体组织中行使不同的功能，主要参与水解寡肽,尤其是从小肽链的N端降解中性氨基酸，同时也参与活性肽的激活或水解、肿瘤细胞侵袭时细胞外基质的降解以及抗原递呈细胞的抗原递呈等多种生物过程[16-18]。另外一个重要作用就是作为病毒受体介导病毒感染。

2.2APN与病毒感染

PEDV为冠状病毒，早已有研究表明同属的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)、人冠状病毒(Human coronavirus，HCoV)229E等都具有共同的细胞受体即APN[19-20]。另外一种重要的冠状病毒人获得性免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)虽然不直接以APN作为病毒的受体，但APN可以通过水解fMLP促进CCR5增敏，进而达到HIV易感的目的[21]。Delmas B等[22]的研究表明，TGEV结合和进入细胞的过程，其中pAPN大量表达，进一步试验证实，pAPN单克隆抗体有能力阻止TGEV感染细胞。另外，通过建立TGEV非易感细胞细胞系证实pAPN是TGEV的受体。Tresnan D B等[23]克隆了猫APN(fAPN)基因，并在仓鼠和小鼠细胞中进行了重组表达，表达后的仓鼠和小鼠细胞易受1型冠状病毒(包括犬冠状病毒、TGE、HCoV-229E)的攻击，但是人APN(hAPN)以及猪APN(pAPN)只能分别受到人冠状病毒和猪冠状病毒的攻击。这些试验证实fAPN可以结合几种不同冠状病毒感染。

Oh J S等[11]首先提出pAPN可能在PEDV感染过程中扮演着病毒受体的作用。通过覆盖病毒蛋白结合试验(VOPBA)，PEDV在Vero细胞上的促感染试验进一步验证pAPN可能是PEDV的受体，而且还能够有效促进PEDV抗体生成。自此之后，我国的科研工作者也进行了对pAPN的相关研究。杨殿奎[24]将pAPN基因成功转染PEDV非许可性细胞(Madin cannie kidney，MDCK)，并用PEDV对转染后的MDCK细胞进行感染，结果显示，MDCK细胞产生PEDV感染病变，用PEDV S蛋白血清与抗pAPN血清进行中和试验验证，MDCK细胞上表达了pAPN。证实了pAPN为PEDV感染细胞的一个受体。

2.3APN与病毒的结合区域

不同物种APN受体功能区域研究表明，APN作为病毒受体的主要功能区域主要集中在C端的Ⅴ区和Ⅶ区。病毒识别受体主要依靠APN蛋白的突变和嵌合。Delmas B等[25]通过构建一系列的pAPN和hAPN的cDNA嵌合体并分析他们促感染的能力，结果显示，pAPN的Ⅶ区第717-813位氨基酸残基是作为TGEV受体感染的活性的必要区域。Kolb A F等[26]对HCov-229E的受体hAPN的功能区域进行鉴定，结果显示，hAPN的Ⅴ区第288-295位氨基酸为HCov-229E的感染必要区域。单智夫[27]对pAPN作为PEDV病毒受体功能域进行了初步鉴定。结果表明，pAPN的受体功能域的位置范围为pAPN的第500-963位氨基酸。孙东波[28]截短表达PEDV S蛋白，对其受体结合域进行了筛选。结果表明，PEDV S蛋白第249～529位氨基酸区域(MRR)是pAPN细胞受体的一个潜在的结合区域。

2.4APN阻断剂研究

病毒与宿主细胞表面受体蛋白的特异性吸附作用是病毒能否侵入宿主细胞以及增殖的关键所在。利用特异性的病毒受体阻断剂竞争结合宿主细胞表面的受体蛋白是切断病毒侵入宿主细胞的一个有效方法，已成为病毒学研究领域的研究热点。

Sun D B等[29]制备出稳定表达猪氨基肽酶N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，并利用T7噬菌体展示系统筛选出了pAPN的单链抗体，并用ELISA进行了验证。由于pAPN的C亚基(PAPN-C)为病毒主要结合区域，与pAPN的酶活性功能区域分开，因此研究人员试图利用阻断病毒的结合区域的方式来抑制病毒与细胞的结合。Guo D H等[30]利用随机噬菌体12肽库筛选出3条能够与PAPN-C结合的噬菌体短肽，MTT试验证实这3条短肽能够在体外有效阻断TGEV感染猪睾丸(ST)细胞。但能否阻断PEDV的感染还有待进一步验证。Meng F等[31]利用噬菌体肽库筛选的与pAPN结合的短肽能有效抑制PEDV感染Vero细胞，但却不能抑制同样以pAPN为受体的TGEV感染。

另外，除了作为病毒受体以外，APN还被认为在肿瘤细胞转移的过程中发挥重要的作用[32]。因此，筛选APN抑制剂也是研究肿瘤治疗的一个热点问题。1976年日本著名抗生素研究者梅泽滨夫从橄榄网状链球菌中分离得到一种小分子肽Bestain能够通过抑制APN来抑制肿瘤细胞的侵袭。之后随着研究的不断深入,大量天然APN抑制剂被发现，如细菌提取物Probestin、Lapstatin,植物提取物姜黄素、白桦脂酸,海洋生物提取物Psammalin A,均能明显抑制APN的酶活性。另外，研究人员也针对药物的实际使用需要研究了一些合成类的小分子类肽氨肽酶N抑制剂，如α-氨基肽类抑制剂、β-氨基-α-羟基苯丁酸(AHPA)抑制剂、α-氨基硼酸抑制剂以及最新研究的indoline-2,3-dione衍生物等，试验证明这些药物也能有效抑制APN[33-35]。对比APN作为病毒受体，作为肿瘤相关因子阻断剂的研究更加深入，这也许可以从某些方面为病毒受体阻断剂的研究提供借鉴。

3　PEDV的其他疑似受体

随着PEDV研究的不断深入，发现PEDV在表达pAPN的ST细胞上不生长，而在不表达pAPN的非洲绿猴肾细胞(Vero)上却能够良好生长，因此，怀疑PEDV可能不只有pAPN这一种受体。朱庆贺[36]利用PEDV感染Vero细胞并进行iTRAQ技术分析筛选差异表达蛋白，发现了126种差异表达蛋白，并对其参与的感染相关通路进行了初步解析，其中一些差异表达蛋白已经有研究证实是一些其他病毒的受体，如整合素蛋白是西尼罗河病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒以及手足口病病毒等的受体。转铁蛋白受体蛋白是犬细小病毒、小鼠乳腺瘤病毒、新世界出血热沙粒病毒的入侵受体。这些蛋白在PEDV的感染过程中表达量明显增加，也有作为PEDV受体的潜质，当然这需要进一步验证。

4　结语

首先，APN功能复杂，作为病毒受体的作用机制尚不够清晰和完善，因此，加大学科交叉研究力度，相互借鉴不同研究领域有助于加深对APN的理解。其次，PEDV的主要防控手段依然是依靠疫苗的接种，尚无有效治疗PEDV的药物，从病毒受体的角度研究PEDV的治疗药物是一种有效的方法。最后，随着蛋白质组学研究的不断深入，蛋白质与蛋白质之间的相互作用已逐渐被揭示。pAPN的持续研究以及其他可疑受体的不断探索，对于PEDV感染机制的阐明有重要意义。

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Advance in Cellular Receptor of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

ZHU Qing-he，MIAO Yan，ZHANG Peng-yu，WANG Guan-yue，CHEN Xi，WANG Shuang，SHI Tong-rui

(Veterinary Research Institute in Heilongjiang Province，Qiqihar，Heilongjiang，161000，China)

Porcine epidemic diarrhea virus mainly causes diarrhea in piglets, with morbidity and mortality often reaching 100%,the development of pig industry had been seriously affected.A virus must bind to a receptor on its surface to enter a cell and replicate.It had been confirmed that the cell receptor of porcine epidemic diarrhea virus was porcine aminopeptidase N(pAPN).In order to make a better understand of the pAPN，the structure and the functional domain of the pAPN had been researched.The researchers also worked on screening of phages that display peptides with an affinity to pAPN to inhibit porcine epidemic diarrhea virus infections.To further study of porcine epidemic diarrhea virus and the receptor,the progress on pAPN were reviewed in this article.

Porcine epidemic diarrhea virus；porcine aminopeptidase N；receptor

2016-04-07

黑龙江省应用技术研究与开发计划(sczzn2014-02)

朱庆贺(1987-)，男，黑龙江大庆人，实习研究员，硕士，主要从事仔猪腹泻研究。*通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)09-0095-04