Raf激酶抑制蛋白在食管鳞状细胞癌中的研究进展

牛中喜,苏立伟　综述　陈龙奇　审校



Raf激酶抑制蛋白在食管鳞状细胞癌中的研究进展

牛中喜1,苏立伟1综述陈龙奇2审校

Raf激酶抑制蛋白；磷脂酰乙醇胺结合蛋白；食管鳞状细胞癌

Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein，RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)的家族成员之一，具有膜的生物合成、精子形成、神经发育等功能，并能抑制促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子kappa-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号转导通路，从而维持细胞正常增殖、分化以及凋亡。RKIP基因的下调或缺失可能导致这些通路的过度活跃以致细胞发生过度增殖及抗凋亡等现象[1-3]。继Fu等[4]发现转移性前列腺癌患者的RKIP表达水平显著低于非转移性前列腺癌患者以来，陆续有大量研究证实在乳腺癌[ 5,6 ]、胃癌[7,8]、肝癌[9]、结直肠癌[10]、前列腺癌[11]、肾癌[12]、神经胶质瘤[13]、肺癌[14,15]、食管癌等[16]肿瘤患者中，RKIP基因表达水平均有不同程度的下调或缺失，表明RKIP可能对肿瘤转移起到一定的抑制作用。显然，RKIP已成为肿瘤学领域研究的一大热点。

有研究表明，RKIP表达的缺失可能是消化系统恶性肿瘤不良预后的独立预测因子，而食管癌作为一种消化系统常见的恶性肿瘤，在世界范围内有着较高的发病率和死亡率[17]。食管癌的组织类型主要分为鳞癌和腺癌，在发展中国家超过80%的食管癌为鳞癌[18]。因食管癌起病隐匿，早期症状不明显，明确诊断时大多已发生局部浸润和淋巴结转移，其5年生存率往往较低。因此，早期诊断是降低食管癌的发病率和死亡率的关键环节。虽然食管鳞状细胞癌的多基因改变和表观遗传学机制已被初步阐述，但其发生发展的确切分子学机制尚不清楚，RKIP或许在一定程度上参与了食管癌发生发展的过程。笔者将对RKIP在食管鳞状细胞癌中的研究进展作综述，以期为食管鳞状细胞癌的早期生物学诊断以及预后判断提供一定的理论依据。

1　RKIP的发现

1984年，Bernier等[1]第一次在牛脑中提取出一种高度保守的小分子蛋白，并将其命名为PEBP-1蛋白。继之，Banfield等[19]从老鼠的精子中也分离出了这种蛋白。1999年，Yeung等[20]用酵母双杂交筛选法纯化出PEBP-1，并发现人PEBP能与Raf-1蛋白激酶结合，从而阻止丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MKK)磷酸化，进而抑制Raf-1/MEK/细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases，ERK)信号通路，因此将其重新命名为RKIP。

2　RKIP的结构和分子生物学特征

PEBP蛋白家族是一类高度保守的小分子蛋白，与现已发现的其他蛋白没有同源性。人RKIP基因定位于12号染色体12 q 24.23，长约10 Kbp，RKIP mRNA由4个外显子转录而来，长度为1434 bp，约95%序列与牛RKIP mRNA相同，85.5%与鼠RKIP mRNA相同。RKIP基因翻译出的RKIP蛋白大小约23 ku，由187个氨基酸组成，其中186个氨基酸与21 ku的牛RKIP重叠，187个氨基酸与23 ku的鼠RKIP重叠[21]。RKIP蛋白分子呈球形结构，使得其与其他蛋白相互作用时具有较大的结合表面。蛋白晶体结构分析显示，RKIP由9个β折叠和4个α螺旋组成，其三维空间结构中有一由1个大β折叠两侧分别连着1个小β折叠和2个α螺旋构成的拓扑结构，该结构存在一个高度保守配体结合域，由PEBP家族高度保守的两段氨基酸序列组成，对RKIP结合磷酸蛋白的功能起决定性的作用[22]。RKIP不同于其他PEBP蛋白的一个显著特征是在其氨基酸序列中存在一个蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化位点Ser153，Ser153被PKC磷酸化后，RKIP与Raf-1的亲和力降低而与G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase，GRK2)的亲和性增高，从而增强G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)的作用。RKIP主要定位于细胞质和细胞膜上，主要通过静电作用与带负电荷的膜结合。人RKIP在多种组织和细胞中均有不同程度的表达，如睾丸精原细胞、大脑胶质细胞、心脏蒲肯野纤维细胞等[23]。

3　RKIP相关的信号转导通路

3.1MAPK信号转导通路MAPK信号转导通路在信号转导中发挥着重要作用，参与细胞增殖、分化、凋亡等细胞活动[24]。MAPK信号转导通路又可分为c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、P38和ERK三条通路，其中Raf/MEK/ERK通路是MAPK信号转导通路中最为活跃的一条。Yeung等[20]的研究发现，RKIP与Raf-1结合后，可抑制Raf-1的活化和磷酸化，进而抑制MEK-1的激活和磷酸化，从而实现对Raf/MEK/ERK通路的抑制。在进一步的研究中，Yeung等[25]发现,MEK和Raf-1在RKIP上有重叠结合位点，而MEK上具有不同的RKIP和Raf-1结合位点，RKIP和MEK在Raf-1上也有不同的结合位点，即RKIP可以分别与MEK和Raf-1结合从而抑制下游ERK途径的信号转导通路。另有研究发现，RKIP与富集在细胞膜的Raf-1结合后，阻止Raf-1与p21活化激酶(p21-activated kinase，PAK)结合，从而阻断PKA和丝氨酸蛋白酶对Raf-1的磷酸化，进而抑制MEK的活化，实现Raf/MEK/ERK通路信号的下调。

3.2NF-κB信号转导通路RKIP能与NF-κB激活途径的4个激酶NF-κB诱导激酶(NF-κB inducing kinase，NIK)、转化生长因子-β活化激酶(TGF-β activated kinase 1，TAK1)、IκB激酶α(IκB kinase α，IKKα)和IκB激酶β(IκB kinaseβ，IKKβ)相互作用，主要通过抑制并减弱肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)诱导的NF-κB抑制物激酶活性，从而实现对NF-κB激活的抑制作用。研究发现RKIP基因敲除的细胞中NF-κB信号通路的负反馈调节因子IκB、A20和Cyld表达会相应下调，表明RKIP通过增加负反馈调节因子的表达来抑制NF-κB信号通路。此外，Sisto等[26]的研究发现,利妥昔单抗可降低NF-κB的活性，并能通过上调RKIP的表达从而实现对NF-κB信号通路的抑制。

3.3GPCR信号转导通路GPCR被GRK-2磷酸化后，与G蛋白脱离而导致G蛋白信号失活。RKIP对GPCR信号转导通路具有正向调节作用。一方面，RKIP是GRK-2的生理性抑制因子，通过结合GRK-2的N端结构域，从而减弱GRK-2对GPCR的磷酸化；另一方面，RKIP Ser153位点被PKC磷酸化后，使其与Raf-1脱离而与GRK-2结合，从而增强GPCR。有研究显示RKIP的二聚化在其从Raf-1结合转换到RKIP结合的过程中起着重要作用，Ser153磷酸化的RKIP极易变成二聚体，且RKIP的二聚体形式与GRK-2亲和力高而与Raf-1亲和力低[27]。在Raf-1和GRK-2之间的这种作用揭示了一种新的信号调节机制，RKIP作为中间调节因子对维持Raf-1的促生长信号和GRK-2的抑生长信号的平衡起着重要作用。

4　RKIP在肿瘤增殖和转移中的作用机制

RKIP通过抑制MAPK以及NF-κB信号通路，从而可抑制细胞增殖和迁移并促进细胞凋亡。当RKIP下调或缺失时，MAPK和NF-κB信号通路激活，细胞增殖侵袭能力增加，游离的Raf-1蛋白激酶向线粒体内异位迁移，抑制细胞凋亡，最终促进肿瘤的发生和发展。RKIP抑制肿瘤转移的具体机制目前尚不清楚，可能与负向调节的信号通路有关。ERK可激活下游转录因子c-myc，使LIN28表达增加，LIN28结合let-7前体物质而使成熟小RNA let-7生成减少，而let-7可通过减少转录因子BACH1的合成来抑制肿瘤转移基因的转录，RKIP则能抑制MAPK信号通路进而抑制肿瘤转移基因的转录表达[28]。文献[29]发现，RKIP能通过抑制NF-κB信号通路从而抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达，基因敲除RKIP的肿瘤细胞MMPs明显升高，侵袭性增强，但同时敲除RKIP和MMPs，肿瘤细胞的侵袭性则回归正常。还有研究发现，蛋白酶体抑制剂可通过诱导RKIP下调E-钙黏蛋白等上皮表型标志物的表达，提示RKIP的缺失可以诱导上皮间质转化从而促进肿瘤转移的发生。同时，RKIP下调或缺失的具体机制目前尚不明确，可能与碱基突变、缺失、甲基化等有关。但RKIP在人类肿瘤中的突变率很低，目前，尚无RKIP基因突变导致基因表达缺失的报道。因此，RKIP基因启动子区高甲基化，以表观遗传学调控机制促进肿瘤发生发展的理论受到比较大的关注。有研究发现，启动子异常甲基化是导致胃癌RKIP转录沉默的主要原因[30]。

5　RKIP在食管鳞状细胞癌中的作用

5.1RKIP在食管鳞状细胞癌中表达下调为了研究RKIP的表达与食管鳞状细胞癌的转移可能性、临床病理特征，以及患者结局的关系，Kim等[31]对138例胸部食管癌患者的肿瘤组织应用免疫组化法来探寻RKIP在原位癌、原发癌以及伴淋巴结转移食管癌中的表达，结果发现，91例食管鳞状细胞癌淋巴结转移灶中，RKIP表达缺失者达65例(71.4%)，表达缺失率显著高于原发癌(50.0%，69/138)和原位癌(28.9%，13/45)。肿瘤病理T分期、淋巴浸润、区域淋巴结转移以及分期与RKIP表达成反比，且RKIP表达下调是发生区域淋巴结转移的独立影响因素。同时，RKIP表达下调的患者术后生存时间显著短于RKIP表达正常的患者。这项研究表明RKIP表达水平随食管鳞状细胞癌的浸润和转移呈下调趋势，RKIP的表达或许可作为一种新的食管鳞状细胞癌的临床生物学标志物。同时，也表明RKIP在食管鳞状细胞癌组织中表达明显低于癌旁组织，在有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中表达明显低于无淋巴结转移的组织，表明RKIP表达的降低促进了食管鳞状细胞癌的淋巴转移。

同时，为了探讨RKIP的表达对食管鳞状细胞癌手术切除患者预后的意义，Gao等[32]进行了一项更大规模的研究，他们对233例食管鳞状细胞癌组织和49例癌旁正常组织运用免疫组化的方法检测RKIP的表达。研究结果显示，食管鳞状细胞癌组织中RKIP的表达显著低于癌旁正常组织，RKIP低表达的食管鳞状细胞癌患者其无病生存率和总体生存率均更低。COX比例风险回归模型分析结果显示，RKIP低表达会增加食管鳞状细胞癌复发的风险。多变量分析结果显示，RKIP的表达水平是影响食管癌患者总体生存率的独立影响因素。该研究表明，RKIP表达对食管鳞状细胞癌的预后判断有积极意义，RKIP或许可成为食管鳞状细胞癌一个新的治疗靶点。

5.2RKIP基因下调与甲基化为了探讨食管鳞状细胞癌细胞中RKIP基因低表达和异常甲基化与肿瘤侵袭和转移的关系，Guo等[33]对食管鳞状细胞癌TE-13细胞株进行了研究。结果表明，RKIP基因启动子甲基化与RKIP低表达密切相关，使用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)去甲基处理后可诱导恢复RKIP的表达。在正常组织中也发现了RKIP基因的异常甲基化，这种启动子异常甲基化可能发生在食管鳞状细胞癌的早期，尤其在不典型增生阶段，且晚期更加明显。他们认为，这种RKIP启动子基因的甲基化表观遗传学的改变导致了RKIP转录的沉默，最终促进肿瘤的侵袭和转移，而RKIP基因的再活化可能对食管鳞状细胞癌有治疗作用，且可作为食管鳞状细胞癌患者的一个预后指标。同时，魏红等[34]的研究发现，食管鳞状细胞癌组织中RKIP启动子的甲基化发生率(75%)显著高于癌旁正常组织(27%)，RKIP基因mRNA阳性表达率(36%)显著低于癌旁正常组织(77%)，且RKIP基因甲基化者mRNA阳性表达率与非甲基化者mRNA阳性表达率比较明显相关，RKIP基因甲基化与肿瘤淋巴结转移和分化程度相关。因此，他们认为，食管鳞状细胞癌RKIP基因启动子甲基化导致该基因mRNA表达缺失可能是食管鳞状细胞癌的发生机制之一，RKIP基因的高甲基化率可作为食管鳞状细胞癌恶性程度评估和预后判断的指标。

5.3RKIP与GPCR通路为了研究RKIP在食管癌细胞增殖中的作用，Zhao等[16]应用免疫组化的方法对食管癌TE-1细胞株RKIP的表达进行检测，发现食管癌组织中RKIP的表达显著低于正常食管上皮组织和癌旁组织，且RKIP低表达与淋巴结转移和远处转移密切相关。RKIP通过下调mRNA中LIN28和MMP-14的表达来实现对食管癌TE-1细胞株的侵袭和转移，RKIP不通过MAPK信号通路对食管癌TE-1细胞株起作用，而通过GPCR信号通路起作用。因此，他们认为，RKIP通过下调GRK-2、LIN28和MMP-14来抑制食管癌细胞的侵袭。同时，魏红等[35]的研究还发现，正常食管组织到食管鳞状细胞癌组织中NF-κBp65表达率逐渐升高，而临床期别越高、分化程度越低的食管鳞状细胞癌组织NF-κBp65表达率越高，有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织表达率较无转移者高，且RKIP与NF-κBp65表达呈显著负相关，表明RKIP表达下调或缺失与食管鳞状细胞癌的侵袭和转移有关，RKIP表达下调或缺失可能通过上调NF-κB的表达促进食管鳞状细胞癌侵袭和转移。

Birner等[36]的研究表明，在食管腺癌中RKIP下调约50%，食管鳞状细胞癌中RKIP下调约66%，且RKIP在Barrett食管、低级别上皮瘤变、高级别上皮瘤变和侵袭性腺癌组织中的表达程度依次降低，表明RKIP的缺失亦参与了食管上皮内瘤变的过程。同时，RKIP表达的下调可降低食管癌患者无病生存率和总体生存率，且是无病生存率和总体生存率的独立影响因素。他们认为，抑制RKIP的下调或许可以延缓食管癌的发生和发展，也可能对治疗食管癌具有潜在意义。

自RKIP被发现二十多年来，其在生物医学研究领域中越来越受到重视，尤其对肿瘤发生发展的作用引来了诸多研究者的关注。RKIP通过对MAPK、NF-κB以及GPCR等信号转导通路进行调节，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要的作用。目前，国内外关于RKIP对食管鳞状细胞癌作用的研究尚不多，且几乎仅停留在免疫组织化学检验水平。现有的研究表明，RKIP在食管鳞状细胞癌中的低表达与肿瘤的侵袭和转移呈正相关，提示可以此作为早期诊断标志，进而成为食管鳞状细胞癌转移治疗的新靶点。同时，利用RKIP促进肿瘤细胞凋亡的作用，可通过提高组织RKIP的表达以介导细胞凋亡，从而提高肿瘤细胞对辅助治疗的敏感性。

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(2015-08-13收稿2016-01-15修回)

(责任编辑郭青)

牛中喜，博士，副主任医师。

1.100039北京，武警总医院胸外科；2.610041成都，四川大学华西医院胸外科

苏立伟，E-mail:slwwjzy@163.com

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