昆虫细胞无血清培养基研究进展

马　伟 ，王家敏，令世鑫，马桂兰 ，马　花，乔自林，马忠仁，冯玉萍

(1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030； 2.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州 730010；3.生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州 730030)



昆虫细胞无血清培养基研究进展

马伟1，王家敏1，令世鑫1，马桂兰2，马花2，乔自林1，马忠仁1，冯玉萍3*

(1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030； 2.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州 730010；3.生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州 730030)

摘要:随着昆虫杆状病毒表达载体系统的广泛应用，昆虫细胞大规模无血清培养已成为一种发展趋势。目前的昆虫细胞培养基中主要有糖类、维生素、氨基酸、脂类、无机盐、有机酸等基础成分，此外还需要添加血清或酵母提取物和水解乳蛋白等血清替代物。然而使用血清会带来诸多难以解决的问题，因此开发使用血清替代物和无血清培养基已成为生物制品行业关注的主要方向。论文综述了昆虫细胞无血清培养基的研究进展，包括研究历程、研究现状、基础成分和其他添加物等。

关键词:昆虫细胞；无血清培养基；血清替代物

昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)具有克隆容量大、重组病毒易筛选、翻译后加工修饰系统完备和外源基因表达能力高等特点，因此与大肠埃希菌表达系统、酵母细胞表达系统以及哺乳动物细胞表达系统并称为当今基因工程的四大表达系统[1-2]。随着BEVS的广泛应用，以草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda细胞株Sf 9和Sf 21，以及粉纹夜蛾Trichoplusiani细胞株Tn5B1-4(商品名High Five)为主的昆虫细胞的体外培养越来越被重视，昆虫细胞培养基也越来越受到人们的关注。最初Grace’s培养基是在Hank’液的基础上通过添加水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate，LH)、酵母提取物(yeast extract，YE)和100 mL/L灭活血清形成的； Gardiner G R等[3]通过修改Grace’s培养基组成适合于苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒在Sf细胞系中生长的培养基并定名为TC-100，但TC-100仅适用于实验室培养而不适用于大规模生产；Weiss S A等[4]改进了最初的IPL培养基，研制了可大规模培养昆虫细胞的IPL-41培养基，利于昆虫杆状病毒的有效生产，同时该培养基很适合细胞无血清培养，作为基础培养基被用于多种无血清培养基的开发。现有的昆虫细胞培养基是在分析昆虫血淋巴的化学组成基础上发展和形成的，目前成分稳定且应用广泛的商品化基础培养基主要是Grace’s、IPL-41和TC-100 3种培养基，这3种培养基在应用中一般要补加3%～15% 的血清用于昆虫细胞培养，而含血清培养基还没有用到大规模的商业化生产中。由于添加血清存在诸多难以克服的困难：如血清来源困难，价格昂贵，质量不稳定，批间差异大，重复性差；血清是支原体和其他异源病毒的重要来源；另外，血清成分复杂，给基因工程表达产物的后处理带来困难，所以低价、稳定且全能型昆虫细胞无血清培养基(serum-free media，SFM)的开发一直是昆虫细胞产业化的主要方向[5]。

1昆虫细胞无血清培养基的发展

昆虫细胞SFM的开发应用始于20世纪80年代。首先，Wilkie G E等开发了培养液CDM，其中含有0.4% YE，它能够维持Sf细胞的生长和生产野生型杆状病毒。关于CDM培养液，除了Ferrance J P等[6]发表的一篇涉及到代谢研究的文章，没有有关CDM 做细胞培养的报道。Roder A用0.5%蛋黄乳液替代脂类分子在TC10培养基中成功地培养了几个鳞翅目细胞系。Maiorella B等[7]在IPL-41中添加0.4% YE及多聚醇F-68乳化的脂质混合物，成功配制无血清培养基ISFM，可使Sf9和其他一些细胞系维持6 L～36 L规模生产巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)。戴琥等[8]以IPL-41为基础培养基，通过添加0.2% LH、0.2% YE以及由胆固醇等组成的脂质微乳浊液，研制出IC-SFM培养基并成功培养High Five细胞，但并未发现用于商业化生产的相关文献报道。以IPL-41培养基为基础还配制了其他商品化无血清培养基，包括Ex-cell系列和Sf900系列培养基，其中Sf900-Ⅱ在很多研究中被广泛应用[9-11]。

近年来，无血清细胞培养技术发展迅速，已报导有多种细胞株系在相应的无血清培养基中生长和增殖获得成功，但由于不同昆虫细胞对培养基的专一性要求，每种培养基都是为培养特定的细胞或特定的培养目的而设计的。例如Thermo Fisher Scientific公司设计开发的Sf-900TMSFM系列和Express Five®SFM：Sf-900TMSFM系列适合Sf9和Sf21细胞系长期生长，其中Sf-900TMⅢ SFM所含水解物浓度更低且无动物源性成分，能够有效提高细胞培养的一致性；Express Five®SFM则适用于High Five细胞系长期培养，使用前需按45 mL/500 mL培养基添加200 mmol/L的L谷氨酰胺。LONZA公司开发出适用于Sf9和Sf21细胞系培养的Insect-XPRESSTM培养基，但由于其不含胰蛋白酶抑制剂，如使用胰蛋白酶消化细胞，应马上离心分离并转移到新培养基中。Sigma-Aldrich公司也开发出适用于Sf9和Sf21细胞系长期培养的EX-CELL®420和EX-CELL®TiterHighTMMedium，且都是完全培养基，使用时无需添加其他成分，而其生产的EX-CELLTM405和Hyclone的HyQ SFX-Insect则更适于High Five细胞系的长期培养[12]。尽管目前已有诸多商品化昆虫SFM，但是细胞在SFM中从几代到十几代不等，都会逐渐出现衰退、老化或死亡等现象，因而每种无SFM都有各自的特点和局限性，还需进一步优化完善。

2昆虫细胞培养基中的基础成分

培养基的设计开发与细胞的新陈代谢研究是密不可分的，基础的代谢研究数据是培养基设计的最基本理论依据，对于设计合理的培养方案以及实现高产量的杆状病毒感染表达也是非常重要的。目前常用的High-Five、Sf9细胞系新陈代谢方面的研究已有相关文章发表[13-14]。

糖类是大部分昆虫细胞首要的能源和碳源，蔗糖虽然也可利用，但它在培养基中所起主要作用是调节渗透压而非能源，如Grace’s培养基中蔗糖含量高于25 g/L，作用即在于此。维生素是维持细胞生长的一种重要生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有积极作用。一般认为，泛酸、异己酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的，而胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖[13]。氨基酸是细胞生长所需的另一类重要物质，其中有14种必需氨基酸，细胞本身不能合成，必须由培养基提供。非必需氨基酸有谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等，其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质的重要材料，缺少谷氨酰胺会影响到细胞的生长速度，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而最后死亡，昆虫细胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培养基中摄取有效，所以各类培养基中都含有较高浓度的谷氨酰胺。周正中指出谷氨酸是昆虫细胞生长过程中一个重要的代谢物(谷氨酰胺代谢的中间体)，在快速生长的昆虫细胞系谷氨酸中被大量消耗，而在生长缓慢的细胞系中它成为代谢产物被积累[15]。非必需氨基酸在感染病毒后的生化反应中有无作用仍需进一步研究。脂类是细胞膜的主要成分，可促进细胞增殖，对其生长必不可少。培养基中的脂类包括不饱和脂肪酸和甾醇，后者昆虫细胞不能合成，因此无血清培养基中脂类的浓度要相应提高。

昆虫细胞培养环境包括pH值、渗透压、盐组分和温度等都不同于哺乳动物细胞。昆虫细胞要在较高的渗透压中生长，一般为340 mOsm/kg～390 mOsm/kg，因而昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+/K+比例在某些细胞系中有严格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+、Al3+等能促进细胞贴附和增加产量，其中Al3+和Zn2+还可以促进病毒的感染和复制，因此昆虫细胞培养基中添加Al3+和Zn2+是很有必要的。在有机酸中，苹果酸、延胡索酸、唬拍酸和a-酮戊二酸等联合使用时，对细胞生长有显著的促进作用，而单独测试时则只有苹果酸有生长促进作用[12]。

3昆虫细胞无血清培养基中的添加物

细胞体外培养最好能接近其原来生长的体内环境，设计适合的培养基是细胞培养能否成功的关键因素。动物血清对细胞生长和细胞分裂有非常重要的作用，是培养基中使用最多最广泛的自然添加物，然而添加血清会产生诸多难以克服的困难，寻找适合的血清替代物一直是培养基设计的主要方向之一，YE和蛋白水解物是目前常用血清替代物。

YE富含水溶性B族维生素和嘌呤碱基，是昆虫培养基中维生素和嘌呤的主要来源。在促进细胞增殖方面YE的作用有一定限度，并非与其含量成比例。而且有研究表明，YE浓度过高反而会抑制细胞的生长[16]。因此，YE的含量应该根据不同的基础培养基或细胞进行调整，一般而言YE的含量应在0.2%～0.6%之间[8,12,17-19]。

蛋白水解物(也称为蛋白胨)是培养基中主要的氨基酸来源，其中LH作为应用最广的添加剂，通常和酵母提取物一起被添加到各种昆虫培养基中。与YE相同，LH对昆虫细胞的作用也不是与其含量成正相关的，其浓度一般在0.2%～0.5%之间[8,17-18]。除水解乳蛋白外，常用于培养基研制的蛋白水解物还包括细菌用蛋白胨、朊蛋白胨和Primatone RL[20]。随着对生物制品安全性要求的提高，非动物源性的材料已成为人们更加关注的方向，植物蛋白水解产物已成为动物源蛋白水解物的理想替代物，其中大豆水解产物正在无血清培养基中发挥越来越重要的作用[21-22]。

脂类一般不直接加入培养基中，而由血清提供。无血清培养基中的脂类物质通常由胆固醇等组成的脂类复合物代替，也有以蛋黄提取物代替脂类复合物和血清配制成的无血清培养基[20]。除上述YE、LH、蛋黄提取物和脂类复合物等生物活性物质外，有些具有促细胞生长的化工原料也可用于代替血清，例如曽庆韬就用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)代替血清配制无血清培养基，并成功培养了果蝇胚胎细胞。

细胞生长因子是维持细胞生存和增殖所必需的物质，随着对其种类和功能的深入了解，细胞生长因子在无血清培养基的开发应用中将会发挥更大的作用。关于脊椎动物细胞的生长因子已经有了一定研究进展，并且已经应用到无血清培养基的开发中[23-24]，但是对于昆虫细胞生长因子的研究却仅仅才是开始。目前已鉴定出2个N末端具有共同序列(Glu-Asn-Phe-)的昆虫细胞生长因子，它们都是ENF家族成员。一个是生长阻抑肽(growth blocking peptide, GBP)，当它的添加浓度为nmol/L 级水平时，能够刺激人角质形成细胞和Sf9细胞的DNA合成[25]。另一个是家蚕麻痹肽(Bombyxmoriparalytic peptide, BmPP)，用来自家蚕胚胎或卵巢的7个细胞系测试BmPP的功能，其促进细胞生长的效果与10-9mol/L～10-5mol/L的FBS基本相同[26]。后来又分离到一种未糖基化的单亚基蛋白质，分子质量约28 ku，其抑制细胞凋亡的活性和全部热处理的血淋巴相同[27]。这些因子在昆虫细胞大规模无血清培养中的综合应用还依赖于其是否能大量、简易地进行分离纯化以及在High Five细胞和家蚕Bm5细胞等其他常用细胞系培养中是否能发挥同样的作用。

昆虫细胞在无血清低蛋白或无蛋白培养基环境中对剪切应力更为敏感，为保护细胞免受剪切力损伤和降低细胞结团，无血清培养基中还需添加一些多聚物保护剂，大致有甲基纤维素、甘油、聚乙烯吡咯烷酮和Pluronic多聚醇(聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物)、硅油和Tween(消泡剂)、维生素E(Vitamin E，抗氧化剂)、Fluronic RF68等。Fluronic RF68是目前应用最广泛的一种保护剂，含量一般在0.1%～0.3%之间[12]。

4昆虫细胞无血清培养基的发展方向

昆虫细胞培养基相对于哺乳动物培养基起步较晚，目前大多数商品化无血清培养基都含有水解乳蛋白、酵母提取物和脂类复合物等生物活性物质，虽然成分相对稳定，但依然不明确，对于其中一些添加物的成分和作用机理还不够了解，因此还需加深细胞代谢及各成分的作用机理的研究，找到适合的成分明确的替代物。现有的商品化基础培养基中营养成分完全足够，添加血清或血清替代物的主要目是弥补合成培养基中缺少的细胞生长因子。随着对血清及其替代物的充分研究和深入了解，人们终将找出其中的促细胞生长因子，并将这类生长因子作为生物活性物质的替代物用于无血清培养基的开发。今后昆虫细胞无血清培养基的设计开发要以成本低、成分明确、批间差异小、稳定性高、产物效率高且易纯化为基础，向着无血清、无蛋白、无动物源性材料的适合多种不同细胞生长的全能型培养基方向发展。

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Progress on Insect Cell Serum-free Media

MA Wei1, WANG Jia-min1, LING Shi-xin1, MA Gui-lan2, MA Hua2,QIAO Zi-lin1, MA Zhong-ren1, FENG Yu-ping3

(1.EngineeringandTechnologyResearchCenterforAnimalCell,Gansu，Lanzhou,Gansu, 730030,China；2.LanzhouMinhaiBio-EngineeringCO．,LTD,Lanzhou,Gansu, 730010，China；3.KeyLaboratoryofBioengineeringandBiotechnologyoftheStateEthnicAffairsCommission,Lanzhou，Gansu，730030,China)

Abstract:With the wide application of insect baculovirus expression vector system, the large scale of insect cell culture has become a developing trend. At present, there are some basic elements such as sugars, vitamins, amino acids, lipids, inorganic salts and organic acids in the insect cell culture media, and it also needs to add serum or serum substitutes like yeastolate and lactalbumin hydrolysate. However, serum will bring many difficulties if being used, so developing and using the serum substitutes and serum-free media has become the main research direction of the biological product industry. This paper summarized the research progress on insect cell serum-free media, including the research history, research status, basic components and other additives, etc..

Key words:insect cell; serum-free medum; serum substitute

文章编号:1007-5038(2016)02-0101-04

中图分类号:Q813.11

文献标识码:A

作者简介：马伟(1986-)，男(回族)，宁夏固原人，硕士研究生，主要从事细胞培养、兽用生物制品的开发研究。*通讯作者

基金项目：教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT13091)；西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(31920150029)；兰州市科技计划项目(2013-4-101)；甘肃省农业生物技术专项(GNSW-2014-24)

收稿日期：2015-07-06