羊传染性脓疱病毒研究进展

林裕胜，江锦秀，林　甦，胡奇林

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013)



羊传染性脓疱病毒研究进展

林裕胜，江锦秀，林甦，胡奇林*

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013)

摘要：羊传染性脓疱病毒是羊传染性脓疱(羊口疮)的病原，能够感染山羊、绵羊和野生小反刍动物，也能够感染人，主要引起口腔黏膜、眼睛、外阴、蹄等部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮，病畜因衰竭和继发感染而死亡。论文对羊传染性脓疱病毒的特征、致病性、致病机理、免疫机理、免疫逃逸机制、检测方法和疫苗研究进行了综述。

关键词：羊传染性脓疱病毒；致病机理；免疫机理；检测方法；疫苗

羊传染性脓疱病毒(Contagious ecthyma virus,CEV)是羊传染性脓疱(羊口疮，Orf)的病原。羊传染性脓疱是一种接触性和嗜上皮性传染病，主要发生于绵羊、山羊、野生反刍动物。该病的主要症状为嘴唇、鼻孔、乳头、口腔黏膜、眼睛、外阴、蹄等出现丘疹或水疱,病畜因衰竭和继发感染而死亡。该病分布广泛，全世界有养羊的国家几乎均有该病发生的报道，该病的发生给我国养羊业造成了严重经济损失。CEV也可感染人，人感染后主要表现为指间和手背、鼻子、嘴唇、面部出现丘疹，免疫失调者可出现非典型增生病变及自身免疫性障碍等并发症。最近也有关于猫和家养驯鹿感染CEV的报道[1-2]。近年来，国内外对CEV进行了深入研究，本文对羊传染性脓疱病毒的特征、致病性、致病机理、免疫机理、免疫逃逸机制、检测方法和疫苗研究等进行综述。

1CEV特征

羊传染性脓疱病毒属于痘病毒科(Poxviridae)，副痘病毒属(Parapoxvirus)，该属成员还有伪牛痘病毒(Pseudocowpox virus，PCPV)、牛丘疹性口炎病毒(Bovine popular stomatitis virus，BPSV)、新西兰马鹿副痘病毒(Parapoxvirusof red deer in New Zealand，PVNZ)。CEV粒子直径250 nm～280 nm，为椭圆形、锥形、砖型及特殊的线团样球形颗粒，外有脂类囊膜，内有双股线性DNA。病毒粒子表面为“8”字型缠绕的螺旋结构，此形态为该病毒独有，易于与其他痘病毒区分。病毒基因组大小为130 kb～150 kb，含有16个开放阅读框，130多个基因，基因组G+C含量丰富，约为63%～64%；基因组G+C含量较高且缺少终止密码子，致使345个蛋氨酸起始的ORFs中有60个缺少终止密码子。CEV由2个相同的反向末端重复序列(ORFs 001～008和ORF 112～134)和中心编码区(ORFs 009～111)组成。2个反向末端重复序列拥有共价闭合末端发夹结构，并且末端重复序列中存在0.5 kb～1 kb的变异片段，临近发夹结构处，有一段小于100 bp的保守序列是DNA复制必不可少的。通过对CEV基因组右末端的BamH I片段的序列测定，发现其包含末端重复序列区约3 388 bp的基因片段。CEV末端 002、024和121基因编码的蛋白具有抑制核转录因子κB(nuclesr factor kappa B,NF-κB)的作用[3]。CEV末端 003、004、008、123、126、128、129基因均可编码锚蛋白重复序列(ankyrin repeat，ANK)，ANK是普遍存在于生物体中的一种蛋白质基序；F盒样蛋白(F-BOX)基序已证明存在于大多数痘病毒的ANK中，参与宿主细胞的泛素/蛋白酶机制[4]。CEV编码的ANK通过F-BOX蛋白基序介导，降解宿主抗病毒因子。病毒转录时缺乏反向末端重复序列将不利于病毒蛋白的生成。基因组的中部与病毒的复制和病毒结构的形成有关，这在病毒的增殖、形态发生和结构组成中均起到很重要的作用；通过与痘病毒序列对比分析，发现与痘病毒基因组的中心编码区同源性极高，证明该区域为高度保守的基因[5]。比如，由CEV 080基因编码产生的蛋白与痘苗病毒(Vaccinia virus,VACA)A4L基因编码产生的蛋白功能十分相似，均在病毒粒子核心蛋白的形成以及形态发生过程中起作用；CEV 086基因是高度保守的基因，编码产生的蛋白与VACA编码的p4a蛋白同源；CEV 088基因编码产生的蛋白与VACA A2L基因编码产生的蛋白同源性达56%[6]。CEV的基因组比较大，因此所编码的蛋白也是丰富多样。其编码的蛋白有10 ku蛋白、42 ku、vIL-10、RNA螺旋酶、RNA聚合酶、GM-CSF抑制因子、拓扑异构酶、病毒粒子相关蛋白、转录因子蛋白、干扰素抗性基因、DNA聚合酶、趋化因子结合蛋白和血管内皮生长因子等[7]。

目前NCBI已经登录了OV-SA00、OV-IA82、NZ2、D1701、NA1-11等5株CEV全基因序列。Andrew A M等[8]通过对3株分离株的基因序列与BPSV进行比对分析，发现BPSV与CEV基因核苷酸相似性达67%～75%，分别含有113个和111个与其他痘病毒属具有同源性的基因，其中分别有88个和90个基因在其他脊椎动物痘病毒基因组中属于保守基因；此外2种病毒基因组中含有127个相同排列顺序和方向的基因，有15个基因为副痘病毒属所特有的。Cotton等通过对CEV和接触性传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus, MOCV)的保守性非结构基因和氨基酸序列同源性及遗传进化树分析，发现CEV基因组虽较MOCV小，然而由于具有高含量的G+C，两者之间的基因组具有更高的相似性，然而末端重复序列存在影响毒力基因和致病因子，因此在不同毒株间也有较高的变异率。

CEV在干燥的痂皮可以存活数月至1年。在寒冷干燥的环境下，可以存活数年，实验室冰箱内可以存活很多年，且不丧失其活力和感染力。将痂皮放置阳光下暴晒，仍有少数结痂内的病毒会存活，依然可感染羔羊发病；长期置放于室温下，病毒的毒力会有一定程度的降低。CEV不耐潮湿、高温、机械性损伤和紫外照射。在潮湿环境中，病毒不容易存活；高温环境， 如60℃水浴 30 min或煮沸3 min即可使其失活；化学试剂如氯仿、苯和甲苯等在一定浓度下可灭活该病毒，对乙醚、苯及丙酮轻度敏感，不耐酸碱，pH越低，病毒效价降低越明显。

CEV不能在鸡胚绒毛尿囊膜和MK2细胞上生长，但可以在多种组织细胞内增殖，原代细胞主要有原代羔羊睾丸细胞、原代羔羊肾细胞、原代胎羊皮肤细胞、原代胎羊肌细胞、羊胚胎鼻甲骨细胞、原代胎牛肌细胞、原代牛睾丸细胞、原代胎牛肺细胞、原代胎牛螺旋状细胞等[9]；传代细胞系主要为madin-darby牛肾细胞和madin-darby绵羊肾细胞、Vero细胞、Hela细胞、狗肾细胞等。病毒一般在接种细胞2代~3代后产生CPE，主要表现为细胞间质增宽，细胞圆缩、肿胀，折光性增强，细胞融汇，形成拉网状，脱落。病变的时间及病变程度有较大差异。从报道看，年轻且繁殖快的细胞较老龄的细胞对CEV更为敏感，产生病变也更为明显。病毒接种细胞后一般在6 h~12 h后能够在细胞内检测到病毒。

2CEV致病性

CEV可致绵羊、山羊、野生小反刍动物发病，主要表现为嘴唇、鼻孔、乳头、口腔黏膜、眼睛、外阴、蹄等出现丘疹或水疱；人感染该病毒主要表现为指间和手背、鼻子、嘴唇、面部出现丘疹，免疫失调者可出现非典型增生病变及自身免疫性障碍等并发症。

3CEV致病机理

CEV经羊口腔、外阴、皮肤黏膜组织等破损处进入机体后，在这些部位的上皮细胞中繁殖，引起上皮层的角化细胞突然增生、肿大；由于病毒感染导致分泌血管内皮生长因子，致使表皮强烈增生和毛细血管高度扩张；血管内的淋巴细胞和单核细胞向外周渗透，产生碱性胞浆内涵体，直至液化，最后形成水泡，继而嗜中性粒细胞移动到网状组织坏死区，形成脓疱；这些部位表面的上皮细胞发生坏死，纤维蛋白凝结，脓疱干燥后结为结痂[10]。

4CEV免疫机理

至今为止，CEV的免疫机理尚不十分清楚，主要包括天然免疫、细胞免疫和体液免疫，其中，以细胞免疫为主。天然免疫方面，CEV在感染的初期，机体的免疫相关细胞如中性粒细胞，CD4+T、CD8+T细胞，B细胞等会在2周内大量富集，4周之后趋于正常；若再次感染该病毒，病程缩短，不到2周就会趋于正常，且免疫相关细胞不会大量增殖，对机体造成的损伤比初次感染小。细胞免疫方面，机体感染CEV后，为抵抗CEV感染首先募集中性粒细胞，并伴随着CD4+T和CD8+T细胞的募集，同时B细胞、树突状细胞的募集通过细胞免疫和MHCⅠ类分子发挥作用[11]。体液免疫方面，机体为抵御CEV的感染，通过B淋巴细胞和中和抗体、特异性抗体产生来发挥作用；中和抗体通过抵御CEV的5种免疫优势性抗原即39 ku膜蛋白F1L、42 ku膜蛋白B2L、10 ku的假定融合蛋白、22 ku和65 ku的蛋白来发挥作用。但是中和抗体产生很少，因此注射超免血清和摄入初乳都不能抵抗病毒的感染[12]。

5CEV免疫逃避机制

CEV初次感染机体后主要侵嗜上皮细胞，患病羊通常在1个月~2个月后自愈。然而再次感染时，CEV与机体免疫系统相互作用过程中，形成一套自身免疫逃避系统，用以抵御机体的清除。当前的研究发现，该系统主要包含以下几个方面：通过CD95途径诱导细胞凋亡；编码参与免疫调节作用的相关蛋白如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、GM-CSF/IL-2抑制因子(the inhibitor of granulocyte-macrophage colony-stimulation facror/interleukin-2,GIF)、CEV-IL-10(a cytokine interleukin-10 orthologue,vIL-10)和CEV干扰素阻抗蛋白(interferon resistance facror,CEVIFNR)、趋化因子结合蛋白(chemokine binding protein，CBP)，这些蛋白主要参与干扰宿主的免疫防御，在病毒免疫逃避中发挥重要作用。

CEV可以通过CD95途径影响机体免疫反应效果，诱导抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs)的凋亡。CEV能表达凋亡蛋白，该蛋白能诱导CD95的表达，从而通过CD95和CD95L途径导致单核细胞和巨噬细胞的凋亡。由于APCs的凋亡，减弱了T细胞免疫应答。

VEGF 是由CEV 132基因(大小约为402 bp)编码产生的一种多肽(类血管内皮生长因子蛋白)，是病毒的一个重要致病因子，在宿主上皮细胞增生中起关键作用，主要是引起上皮细胞的有丝分裂和广泛的血管变化，而且能够激活病毒VEGF受体，促使病毒感染靶细胞并导致细胞凋亡[13]。通过对敲除VEGF基因的毒株与野毒株同时进行动物攻毒试验，发现缺失VEGF基因的毒株其致病性明显减弱[14]。研究还发现，不同CEV毒株的VEGF基因序列相似度差异很大，但所编码蛋白的功能域却是极为保守的一段序列[15]。

CEV-IL-10 由大小约为561 bp的CEV IL-10基因编码, 是病毒感染早期表达的蛋白之一，是潜在的抗炎症细胞因子，可抑制单核-巨噬细胞分泌TNF-α、抑制巨噬细胞分泌IL-8、抑制淋巴细胞分泌IFN-γ等，从而抑制宿主的非特异性免疫反应[16]。此外CEV-IL-10能够降低IL-12的表达，进而抑制DC细胞表面标记物MHCⅡ类分子的活化和成熟。且通过抑制CD4+T细胞的活化，造成DC细胞功能衰减导致获得性免疫力下降。最新研究表明，CEV-IL-10是一种毒力因子，是造成CEV反复持续性地感染宿主的一个主要因素[17]。

GIF 由CEV 117基因编码的类GM-CSF/IL-2抑制因子蛋白，含有256个氨基酸。GIF蛋白可以结合宿主分泌的细胞因子GM-CSF和IL-2，抑制白细胞、Th0和CTL细胞的增殖，减弱宿主免疫系统对病毒的杀伤作用。

IFNR 由CEV020基因编码的干扰素阻抗蛋白，含有183个氨基酸。在宿主抵抗病毒的反应中，双链RNA激活的蛋白激酶(double stranded RNA activated protein kinase，PKR)磷酸化可以结合翻译起始因子eIF-2α，从而阻断病毒复制和细胞蛋白的翻译。IFNR蛋白能够特异性结合dsRNA阻扼PKR基因的磷酸化，进一步抑制PKR蛋白激酶的活性，与PKR竞争结合病毒复制的中间体，从而阻止宿主细胞干扰素终止病毒蛋白翻译[18]。

CEV-CBP 由CEV112基因编码的趋化因子结合蛋白，含有286个氨基酸。在病毒早期复制过程中，能够有效地结合趋化因子，阻止趋化因子与相应的受体作用。CEV-CBP拥有结合CC型炎症趋化因子的能力，从而抑制单核-巨噬细胞、T淋巴细胞向炎症部位聚集，其他痘病毒则不能[17]。此外，CEV-CBP还能与C型趋化因子结合，进而抑制嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞向炎症部位聚集[19]。

科学家还发现CEV基因组中还存在可以编码免疫逃避机制的相关基因。如CEV121基因，该基因的缺失可明显降低CEV对羊的毒性和致病性；CEV024基因，该基因编码的蛋白可通过抑制NF-κB信号通路，进而抑制宿主免疫细胞分泌的一些重要因子[20]。

6CEV检测方法研究

近年，CEV的检测方法主要有电子显微镜检查、免疫电镜检查、病毒分离鉴定、血清学检查、分子生物学检测方法等。

6.1电子显微镜检查

主要是通过观察病毒粒子的形态但是由于副痘病毒与其他痘病毒的大小几乎差不多很难通过电子显微镜来区分，不利于病原的确诊。

6.2免疫电镜法

主要是通过病毒的形态学和免疫学相结合，利用病毒特异性抗体结合CEV进行检测，此法增强了诊断的特异性。

6.3病毒分离鉴定

主要是利用原代羔羊睾丸细胞、原代羔羊肾细胞或传代细胞系进行病毒分离，再用PCR等方法鉴定。

6.4血清学方法

主要包含反向间接血凝试验、琼脂扩散试验、对流免疫电泳、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、蛋白质印迹技术等。反向间接血凝试验、对流免疫电泳是我国科研工作者沈正达等率先在国内外首创的。利用A蛋白、G蛋白和重组蛋白A/G过氧化物酶标记建立的间接酶联免疫吸附试验方法检测CEV抗体，该方法已用于人、骆驼和羊的检测。通过蛋白质免疫印迹技术，已从感染动物的阳性血清中检测到CEV 40 ku免疫原性蛋白，通过此法还检测到了2个20 ku和22 ku的蛋白。

6.5分子生物学检测方法

主要包含PCR、实时定量PCR、环介导等温扩增技术、限制性片段长度多态性分析。PCR检测方法已经非常成熟，主要针对F1L和B2L等保守基因进行检测。Mondal B等[21]针对B2L基因建立了半套式PCR，该方法能够检测到低拷贝两的病毒粒子。余波等[22]针对B2L基因建立了PCR检测方法，该方法能够检测最低核酸量1.2 fg/μL。郑敏等[23]针对CEV的pL基因和羊痘病毒的A29L基因建立了双重PCR方法，该方法可用于鉴别CEV和GPV。向智龙等[24]针对CEV pL基因和山羊痘病毒ITR基因建立了双重PCR，该方法具有较强特异性和敏感性。实时定量PCR诊断方法主要针对B2L基因进行扩增，该方法在国内外均有广泛应用[25-28]。Jida L等[29-30]建立了环介导等温扩增方法，该方法具有快速、准确、敏感、方便等优点。限制性片段长度多态性是通过从病料中抽提病毒DNA，利用酶切病毒基因组产生随机酶切片段进行分析，Mazur等建议使用Dra I进行羊口病毒分离株的基因组分型。

7CEV疫苗研究

目前报道的CEV疫苗有灭活苗、细胞弱毒苗、囊膜亚单位疫苗、核酸疫苗和重组疫苗等。

7.1灭活疫苗

Boughton等1930年在德克萨斯研制了CEV疫苗，该疫苗株是从绵羊身上获得，Dela于1999年发现此疫苗不能对山羊起到保护作用。随后Buddle、Pulford等在1984年用CEV灭活疫苗分别对分娩前3周～4周孕羊及孕羊所生羔羊进行免疫；试验结果显示，免疫过灭活疫苗的孕羊所产羔羊与空白对照组有相似症状，发生了CE，产生结痂，免疫弱毒苗组症状较轻，不产生结痂，可见高水平的母源抗体并不能很好的抵御CEV的感染,Andrew、Mathiesen等也印证了此结论。田婷婷等[31]于2013年用灭活苗免疫94只孕羊，对孕羊血清进行中和抗体检测，结果显示孕羊中和抗体水平较对照组有显著升高。张立强等[32]用蜂胶佐剂灭活疫苗分3次免疫36只孕羊，免疫14 d后分离血清，进行中和抗体检测，结果显示，血清中含有较高中和抗体。

7.2弱毒疫苗

Ramyar等1973年利用原代肾细胞对CEV进行28次传代，降低毒力后接种羔羊，可维持半年的免疫力。西德等1981年利用羊肾细胞对CEV进行135次传代，皮下注射1万只羊，羔羊发病率较往年显著下降。杜森茂等1988年研制成羊传染性脓疱皮炎睾丸细胞弱毒冻干苗，免疫保护率达75%，保护期近180 d。Pye等对羔羊采用划痕方式进行CEV弱毒苗接种，5周后进行攻毒试验，结果显示免疫过的羔羊虽发病但症状较对照组轻。Nettleton 等1996年用CEV弱毒苗划痕接种8日龄羔羊，分别在3个月和6个月后进行攻毒试验，结果显示免疫过3个月后攻毒，羔羊虽发病但与对照相比，没有出现典型病理变化；免疫过6个月后攻毒，免疫组也出现结痂，说明疫苗保护力下降。Mercante等2008年利用鸡胚成纤维细胞将CEV传10代，采用肌肉注射免疫山羊，免疫后14 d测血清抗体效价，1个月后划痕接种CEV强毒，结果显示，免疫后的羊抗体效价高，没有出现结痂症状。田婷婷[31]利用犊牛睾丸原代细胞对分离的CEV传代85代，采用划痕免疫接种羔羊唇部，2个月后划痕接种CEV强毒，结果显示，接种该苗的羔羊没有出现水泡、结痂等症状。

7.3病毒囊膜亚单位疫苗

左玉婷等1994年利用获得的病毒囊膜表面糖蛋白与弗氏佐剂混合后免疫羔羊，可引起羔羊体内迟发性变态反应，且能够产生一定滴度的CEV特异性抗体，由此可见该用亚单位疫苗免疫羔羊可产生一定的免疫保护。在2004年表达了CEV F1L基因，用纯化的F1L重组蛋白与弗氏佐剂进行混合，研制成CEV亚单位疫苗，用该疫苗皮下免疫家兔2次，第3次静脉注射，3次免疫后测血清中和抗体，结果显示，重组蛋白能够刺激中和抗体的产生，说明F1L重组蛋白具有一定的免疫原性。以上这些疫苗均属于实验室试验阶段，尚未进入临床应用[32]。

7.4核酸疫苗

赵魁等[33]研制的pcDNA3.1-ORFV011/059 DNA疫苗,试验用100 μg pcDNA3.1-ORFV011/059DNA质粒免疫小鼠，对小鼠淋巴细胞增殖反应、血清中和抗体水平等进行评估，结果显示该疫苗不仅可产生高滴度的中和抗体，还可引发机体细胞免疫。

7.5重组病毒疫苗

Fischer T等[34]用高度致弱的CEV D1701毒株作为病毒载体表达了伪狂犬病毒的糖蛋白gC和gD。Jestin等2003年以CEV D1701毒株作为载体表达了博纳病毒p40蛋白；以CEV作为载体表达猪瘟病毒E2糖蛋白，结果显示可以高效表达E2糖蛋白[26]。用细粒棘球绦虫的EG95替代CEV基因组中的G1L基因，构建重组病毒载体疫苗，希望由此获得双重保护[35]。有学者设想通过随机克隆CEV基因组的DNA片段插入到VACV载体上，构建表达载体既能表达CEV保护性抗原，又能抵御VACV的入侵。张倩等[36]构建了以山羊痘病毒为载体，表达CEV F1L基因的重组山羊痘病毒疫苗株，为CEV基因工程载体疫苗奠定基础。

8结语

近年来，对羊传染性脓疱病毒的基因结构和功能、病毒逃逸的分子机制、新型疫苗等方面进行了大量研究，取得了显著进展，但是，由于羊传染性脓疱病毒免疫的特殊性，至今为止，还没有安全、高效的羊传染性脓疱病毒疫苗，而当前用于预防羊口疮的疫苗主要是弱毒疫苗， 其存在安全性不够好、有毒力返强、 不能区分野毒感染等缺点，因此，研究安全、高效的疫苗是今后研究的重点。同时，目前尚无准确、快速检测羊传染性脓疱病毒抗体的试剂，准确、快速检测抗体试剂的研究也是今后的研究方向之一。

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Progress on Contagious Ecthyma Virus

LIN Yu-sheng, JIANG Jin-xiu, LIN Su, HU Qi-lin

(InstituteofAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian,350013,China)

Abstract:Contagious ecthyma virus(CEV) is the pathogen of contagious ecthyma(CE), and could infect goats, sheep,wilde small ruminats and people. CEV mainly causes papules,vesicles,pustules and verrucous scabs in oral mucosa,eyes,vulvae,hooves. The sick animals may be dead because of failure and secondary infection. In this paper, CEV research progresses on virus characteristics, pathogenicity,mechanism of pathogenesis, mechanism of immunity, immune escape mechanism, detection methods and vaccines were reviewed.

Key words:Contagious ecthyma virus;; mechanism of pathogenesis; mechanism of immunity; detection method; vaccine

文章编号:1007-5038(2016)02-0091-06

中图分类号:S852.65

文献标识码:A

作者简介：林裕胜(1988-)，男，福建漳州人，研究实习员，硕士，主要从事临床兽医学和动物传染病学研究。 *通讯作者

基金项目：福建省公益类项目(2014R1101002-8)

收稿日期：2015-04-14