应用分子靶点药物治疗犬肥大细胞瘤的研究进展

李格宾，杨紫嫣，林珈好，夏兆飞

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)



应用分子靶点药物治疗犬肥大细胞瘤的研究进展

李格宾△，杨紫嫣△，林珈好，夏兆飞*

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

摘要:犬肥大细胞瘤因其恶性率和转移率都较高，并且常规化疗药物副作用较强，患犬生存期和生存质量显著下降，因此急需新型的药物进行治疗。近几年，治疗肿瘤的分子靶点药物凭借其疗效好、副作用低的特点，受到越来越广泛的关注，特别是在治疗犬肥大细胞瘤的应用中效果显著。论文重点介绍了欧美小动物临床最常用的伊马替尼、托赛拉尼、马赛替尼这3种以异常KIT为靶点的药物及其药物作用机理及药效，最后介绍了由c-kit基因二次突变所导致的耐药问题及其预防措施，期望能对我国小动物临床医师和科研工作者有所启发。

关键词:犬;肥大细胞瘤；分子靶点药物；c-kit基因

近些年，随着肿瘤分子生物学领域迅猛发展，分子靶点药物治疗受到了广泛的关注。这类药物的机理是，在细胞分子水平上针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)来设计相应的治疗药物，该药物进入体内会特异性地选择并结合致癌位点来起作用，有针对性地使肿瘤细胞死亡，而不会波及肿瘤细胞以外的正常组织细胞，所以分子靶点药物又称为“生物导弹”。人医临床上靶点药物主要分为2类，一类是单克隆抗体，另一类是小分子化合物。单克隆抗体的主要成分为大分子蛋白，由于其是人源化单抗，动物应用后会出现严重的过敏反应，因此只有小分子类的靶点药物可用于小动物临床。近些年小动物临床肿瘤疾病发病率越来越高，小分子化合物类靶点药物逐渐成为研究的热点，尤其对犬肥大细胞瘤(mast cell tumor，MCT)的研究最具有代表性，目前已有大量的研究和临床病例报告证实,分子靶点药物对犬MCT确实疗效显著，该类药物的代表有伊马替尼、托赛拉尼和马赛替尼，其中托赛拉尼和马赛替尼已被欧洲药品管理局(European medicines agency, EMA)和美国食品药品管理局(Food and drug administration, FDA)批准专门用于小动物临床。该类药物的作用机理是：通过竞争性抑制ATP与突变的酪氨酸激酶受体结合，阻断酪氨酸激酶受体活化中心的磷酸化作用，从而抑制其活化，最终起到抑制肿瘤细胞增殖的作用[1]，尤其是对于已发生c-kit基因突变的MCT效果更加显著，而对于未突变的MCT效率较低。同时多项研究发现该类药物的副作用相较于传统化疗药物要低很多。如今，我国小动物临床也逐渐引进并开始使用分子靶点药物治疗犬MCT，以期能够显著提高MCT患犬的生存期和生活质量，下面对治疗犬MCT的分子靶点药物相关研究进展做一概述。

1犬肥大细胞瘤的病因学概述

1.1c-kit基因及KIT蛋白

c-kit 基因编码 Ⅲ 型酪氨酸激酶跨膜受体(KIT蛋白)，它的配体是干细胞因子(stem cell factor，SCF)。c-kit基因包括21个外显子(exon)，编码了KIT蛋白的5个膜外免疫球蛋白样区域(由exon1~9编码)；跨膜区(exon10)和膜内区(exon11~21)[2]。像其他酪氨酸受体那样，只有捆绑配体才能导致受体(KIT)二聚化，随后激活酪氨酸激酶，最终使细胞启动自动磷酸化与外源性基质的磷酸化，这些磷酸化作用将会引起下游信号转导，激活细胞内信号通路[2-3]。KIT受体信号在红细胞生成、淋巴细胞生成、肥大细胞的成熟和功能完善、巨核细胞生成、配子生成、黑色素生成中具有重要作用[4]。

1.2c-kit 基因突变

随着分子生物学研究方法逐渐应用于小动物临床，欧美及日本等国家研究发现，有将近15%~40%犬MCT包含c-kit基因突变，目前发现的突变包括：点突变，内部序列重复突变(internal tandem duplication，ITD)，缺失突变[2, 5]。在诸多犬MCT的病例中，已经确认的突变位点有exon8、 exon9、exon11和exon17。这些突变(c-kit激活性突变)导致 KIT 蛋白无需依赖配体(SCF)，自身即可持续磷酸化[2]。KIT蛋白异常磷酸化会导致下游信号不受控制，最终引起细胞增殖与凋亡周期失控。 已发现的犬突变位点中exon11的突变率最高，占突变总数的14%~21%[6]，另有研究认为高达64%[2]；exon8 突变率约为4.7%；exon9 突变率约为4.2%[2]；其他exon的突变均小于3%[6]。在exon8、9、11 的突变中，exon8大部分为ITD突变，极少数为点突变；exon9 全部为点突变；exon11 大部分为ITD突变(占突变总数9%~17%[6])，极少数为点突变和碱基缺失突变；exon17 全部为碱基缺失突变[2]。

2治疗犬MCT的常规化疗药物

在我国小动物临床中，尚未开展对肿瘤病例的放射治疗方式，所以对于单发的MCT且能达到手术要求的，通常都会采取手术切除，而对于已发生远端多处转移、肥大细胞血症、肿瘤部位不能大范围手术切除或患犬体况不适合进行手术的，通常采取药物治疗。目前小动物临床可以用来治疗犬MCT的常规化疗药物有长春花碱(vinblastine，VBL，2mg/m2)、洛莫司汀(lomustine，CCNU，70 mg/m2~80 mg/m2，每3周1次，口服)和泼尼松(prednisone，2mg/kg，每日1次，口服)。但是其副作用也令很多MCT患犬生活质量大幅下降，例如,VBL会引发骨髓抑制，消化道反应(厌食、呕吐、腹泻)，外周神经毒性和注射部位局部刺激；CCNU会导致骨髓抑制、急性中性粒细胞减少症和血小板减少症，慢性给药时会出现肝功能异常，需要暂时或永久性停药[7]；长期使用泼尼松会导致医源性肾上腺皮质机能亢进[7]，继而引发多饮多尿、骨质疏松等症状，还可能诱发或加重胃溃疡[8]。

如果将VBL、CCNU与泼尼松联合用药，不但可以降低单独药物的使用剂量、减轻副作用，更可提高药物的疗效，起效率可达65%[7, 9]。

3治疗犬MCT的分子靶点药物

分子靶点药物统称为小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)。它们的作用机理是竞争性结合已突变KIT蛋白的ATP结合位点，从而阻断ATP结合来抑制突变KIT蛋白获能，切断细胞增殖信号通路，抑制细胞异常增殖，诱导细胞死亡[10]。

一般评估肿瘤的治疗效果通常遵循Response evaluation criteria in solid tumors(RECIST，2009)准则[11]：完全缓解(complete remission，CR)；可见损伤消失或部分缓解(partial remission，PR)；肿瘤最大直径至少增加20%，渐进性疾病(progressive disease，PD)；病情稳定(stable disease，SD)。下面主要介绍3种已应用于犬MCT的治疗以突变的KIT为靶点的分子靶点药物。

3.1伊马替尼

伊马替尼(Imatinib，商品名：格列卫®Gleevec®，Novartis)是由计算机开发设计的一种低分子量有机化合物类型的分子靶点药物，其作用机理为抑制BCR-ABL、KIT、血小板生长因子、集落刺激因子1受体、ABL1、ABL2、圆盘状结构受体1/2和淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶活化[6]。目前已经广泛应用于治疗人慢性粒细胞白血病(chronic myelognous leukemia, CML)、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GIST)和费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病。由于其疗效显著，目前已作为CML和GIST治疗的标准用药，也是迄今为止最成功的TKIs类药物。对于小动物临床治疗肿瘤疾病，伊马替尼于2009年开始在美国小动物临床上使用，2013年开始在日本小动物临床上广泛使用[6, 10]。伊马替尼对存在c-kit exon8、9、11突变的MCT患犬效果非常好，基本可以达到100%的CR或PR(16/16)；对c-kit未知位点突变的MCT患犬效果同样明显，也可达到100%CR(3/3)；而对未突变的MCT患犬效果欠佳，有效率仅22.7%，并且不能达到CR或PR的标准[6]。其使用剂量为每天5 mg/kg~10 mg/kg，口服，最低起效剂量可以降低至每天4.4 mg/kg。药效学研究发现，用药后患犬的平均生存时间可以达到147 d以上[6]，并且Nakano Y等[12]报道的2例c-kit基因exon11突变的病例也支持这一结论，其中一例发生ITD的患犬使用伊马替尼后生存了233 d，另一例发生点突变的患犬生存了328 d。虽然伊马替尼可能对部分犬有肝毒性，使丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase， ALT)和碱性磷酸酶(alkaline Ahosphatase，ALP)升高，但是当停止给药后肝脏指标会逐渐好转[10]。迄今为止的多项研究证实，伊马替尼带来的副作用比传统化疗药物要小很多[6]。

伊马替尼对发生c-kit基因突变的MCT效果显著，对于不存在异常c-kit基因的MCT细胞几乎没有作用，因此使用伊马替尼是十分具有针对性的。然而伊马替尼的价格相对昂贵，盲目使用会造成很大浪费，所以建立高精度判别伊马替尼适应症的检测是十分必要的，所以临床上必须在使用伊马替尼前检测c-kit是否有突变。

3.2托赛拉尼

托赛拉尼(Toceranib)是首个被欧洲药品管理局和美国食品药品管理局批准专门用于小动物临床的分子靶点药物，其作用机理为抑制KIT活化，并作用于血管内皮生长因子受体2和血小板衍生生长因子β，可作为首次治疗使用也可用于对伊马替尼不敏感的MCT患犬，其使用剂量为每次3.25 mg/kg，隔天使用1次，口服[1, 10]。托赛拉尼对c-kit基因突变的MCT患犬起效率可以达到90%以上(10/11)，平均12周可以见到预期的治疗效果；对于未突变犬的起效率也可达30%，平均18.1周可以见到预期治疗效果。在一项更大样本量的研究中发现：托赛拉尼对于MCT患犬的总起效率为42.8%(62/145)；对c-kit基因突变的起效率为82%；对未突变的起效率为55%。其对于未发生淋巴结转移的MCT有更高的起效率，为67%；若发生了淋巴结转移，起效率为46%[7, 10]。如果将托赛拉尼与VBL联合使用，不仅药物的使用剂量可以降低，还能够将药物的起效率提高至71%，超过每种药物单独的起效率[13]。

托赛拉尼的副反应主要是胃肠道反应，包括厌食、腹泻，少数情况会呕吐，但是这些副反应都可以在配合用药的情况下被有效控制[14]；托赛拉尼的特异性副反应还有白细胞减少症，但是白细胞降低的程度并不会使患犬有细菌感染的风险，通常用药几天后白细胞数量就能够自发恢复正常；极少部分犬会产生肌肉抽筋的情况，此时应用非甾体抗炎药物、曲马多或停药一段时间都能缓解这种情况。有意思的是，当患犬出现过一次上述副反应并重新开始用药之后，这些副反应便不会再发生了[10]。

托赛拉尼在欧美和日本广泛用于治疗犬MCT，目前已有大量临床数据支持其药效。虽然托赛拉尼对没有c-kit基因突变的患犬也有一定的效果，但针对c-kit基因突变的犬来使用可大幅度提高其有效率，因此c-kit基因检测也是非常必要的。托赛拉尼是专门用于小动物临床的药物，应用前景广阔，希望我国小动物临床早日引进这种药物，对MCT患犬进行有效治疗。

3.3马赛替尼

马赛替尼(Masitinib)是被批准用于小动物临床的第2种TKIs类药物，其不仅抑制KIT活化，还作用于血小板衍生生长因子受体α与β和细胞质LYN激酶，使用剂量为12.5 mg/kg，每天1次，口服[1, 10]。在一项超过200只MCTⅡ级、Ⅲ 级犬参与的试验发现，马赛替尼的总起效率虽然与对照剂无明显差异(15%和16%)，但是马赛替尼抑制肿瘤增长的时间明显长于对照剂(118 d和75 d)，该试验还发现马赛替尼对c-kit突变的MCT患犬起效率(20%)并不像前2种药物那么高[15]。另有研究发现马赛替尼与对照剂相比，可明显提高患犬的存活率和存活时间，12个月时MCT患犬的存活率分别为62.1%和36%；24个月时为39.8%和15%，还有一点值得注意：当肿瘤在6个月内被逐渐抑制时，患犬有可能生存长达2年，但当肿瘤在6周内被迅速抑制时，患犬预后反而不良，生存时间比前者要短[16]。

马赛替尼的副反应与前2种药物相类似，但临床应用中仅出现过轻度的呕吐和腹泻症状，而且这些症状都可以通过联合用药控制；特异性副反应有蛋白丢失性肾病和溶血性贫血，但是发生概率较低[10]。目前对于马赛替尼的临床应用尚缺乏大量数据，其效果也不如伊马替尼和托赛拉尼，一般用于对以上2种药物不敏感的MCT患犬。

3.4TKIs类药物导致c-kit基因二次突变

TKIs类药物通常能够迅速起效，并且能够达到50%以上的起效率，比普通化疗药物的起效率要高很多。但是，这些药物并不是一直起效，通常在肿瘤复发之前只能维持平均6个月~18个月起效期。导致TKIs药物失效的最主要原因是c-kit发生二次突变，推测有4种可能性：①药物无法与二次突变的KIT结合；②药物与二次突变的KIT无关位点结合，不能抑制KIT与ATP结合；③肿瘤细胞过度表达二次突变的KIT，使药物很快被耗尽；④肿瘤细胞激活其他增殖途径[14]。在2015年，Kobayashi M等[17]发现exon17的二次突变会导致药物失效，并且如果最开始使用的TKIs药物剂量较高，那么将更快产生耐药性，并且使药物再次起效所需的剂量将更高。

这对于犬MCT的治疗来说是一个很大的挑战，临床医师不仅需要提前预想到这个问题，而且应在肿瘤复发之前制定好应对策略，比如合理地联合使用2种TKIs类药物，或同时使用TKIs类药物与细胞周期化疗药物，以便相应降低每种药物的单独使用剂量[14]。根据Burton J H等[18]的研究发现，将托赛拉尼和洛莫司汀联合用药，每7天内的第1、3、5天以2.75 mg/kg的剂量使用托赛拉尼，同时以50 mg/m2的剂量隔天使用洛莫司汀，连续用药21 d后发现起效率达46%以上，并且未发生胃肠道或肝毒性反应。

4小结

由于犬MCT的发生率、恶性率和转移率都较高，因此对于恶性MCT的患犬，目前的传统治疗药物很难达到期望的效果，而采用过于激进的治疗方法也会导致患犬生活质量严重下降。目前关于肿瘤治疗药物的种类繁多，特别是抗肿瘤多肽疫苗和诱导肿瘤细胞凋亡的中药制剂、植物提取物(如血根碱)为研究热点，但若应用在小动物临床还需更多临床试验[19-21]，所以寻找治疗犬MCT的新型药物就变得十分紧迫。分子靶点药物由于其起效迅速、起效率高、副作用小已被越来越多的兽医师所重视，虽然还需要更多使用分子靶点药物的病例报告和药物研究数据，但是这种化疗药物无需置疑会成为治疗犬MCT未来的主要发展方向之一。希望此文能对我国的小动物临床医生和科研工作者有所启发，使分子靶点药物早日投入到临床治疗犬MCT的使用中去。

参考文献:

[1]Costa R M G D. C-kit as a prognostic and therapeutic marker in canine cutaneous mast cell [J]. Vet J, 2015, 205(1): 5-10.

[2]Letard S, Yang Y, Hanssens K, et al. Gain-of-function mutations in the extracellular domain of KIT are common in canine mast cell tumors[J]. Mol Cancer Re,2008, 6(7): 1137-1145.

[3]Gilfillan A M, Rivera J. The tyrosine kinase network regulating mast cell activation[J]. Immunol Rev,2009, 228(1): 149-169.

[4]Roskoski R. Structure and regulation of Kit protein-tyrosine kinase-the stem cell factor receptor[J]. Biochem Biophy Res Co,2005, 338(3): 1307-1315.

[5]Takeuchi Y, Fujino Y, Watanabe M, et al. Validation of the prognostic value of histopathological grading or c-kit mutation in canine cutaneous mast cell tumors: A retrospective cohort study[J]. Vet J,2013, 196(3): 492-498.

[6]Bonkobara M. Dysregulation of tyrosine kinases and use of imatinib in small animal practice[J]. Vet J,2015, 205(2): 180-188.

[7]Withrow S J M. Small Animal Clinical Oncology[M]. Sanuders:2012: 330-346.

[8]刘举，张美荣，王洋，等. 多靶点酪氨酸激酶抑制剂帕纳替尼的研究进展[J]. 辽宁大学学报:自然科学版,2014(4): 347-355.

[9]Blackwood L, Murphy S, Buracco P, et al. European consensus document on mast cell tumors in dogs and cats[J]. Vet Comp Oncol,2012, 10(3): e1-e29.

[10]London C A. Tyrosine kinase inhibitors in veterinary medicine[J]. Topics Compa Anim Med, 2009, 24(3): 106-112.

[11]Eisenhauer E A, Therasse P, Bogaerts J, et al. New response evaluation criteria in solid tumors: revised RECIST guideline (version 1.1)[J]. Eur J Cancer,2009, 45(2): 228-247.

[12]Yuki N. Imatinib responsiveness in canine mast cell tumors carrying novel mutations of c-KIT exon 11[J]. Intern Med,2014,76(4):545-548.

[13]Robat C, London C, Bunting L, et al. Safety evaluation of combination vinblastine and toceranib phosphate (Palladia) in dogs: a phase I dose-finding study[J]. Vet Comp Oncol,2012, 10(3): 174-183.

[14]London C A. Kinase dysfunction and kinase inhibitors[J]. Vet Dermatol, 2013, 24(1): 140-181.

[15]Hahn K A, Oglivie G, Rusk T, et al. Masitinib is safe and effective for the treatment of canine mast cell tumors[J]. J Vet Intern Med,2008, 22(6): 1301-1309.

[16]Hahn K A, Legendre A M, Shaw N G, et al. Evaluation of 12- and 24-month survival rates after treatment with masitinib in dogs with nonresectable mast cell tumors[J]. Am J Vet Res,2010, 71(11): 1354-1361.

[17]Kobayashi M, Kuroki S, Tanaka Y, et al. Molecular changes associated with the development of resistance to imatinib in an imatinib-sensitive canine neoplastic mast cell line carrying aKIT c.1523 A>T mutation[J]. Eur J Haematol,2015,12. doi: 10.1111/ejh.12526.

[18]Burton J H, Venable R O, Vail D M, et al. Pulse-administered toceranib phosphate plus lomustine for treatment of unresectable mast cell tumors in dogs[J]. J Vet Intern Med,2015, 29(4): 1098-1104.

[19]万岩岩，钟静静，高宁宁，等. 肿瘤多肽疫苗研究进展[J]. 动物医学进展,2015, 36(2): 101-105.

[20]邱淑敏，陈涛，刘美玲，等. 中药诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展[J]. 动物医学进展,2015, 36(1): 83-86.

[21]林海，薛立群，杨青. 血根碱抗肿瘤作用研究进展[J]. 动物医学进展,2014, 35(5): 105-107.

Progress on Application of Molecular Target Drugs in Treatments of Canine Mast Cell Tumors

LI Ge-bin, YANG Zi-yan, LIN Jia-hao, XIA Zhao-fei

(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

Abstract:Mast cell tumors (MCT) have the high metastatic and mortality rate. Moreover, the conventional chemotherapy drugs have many unpleasant side effects. As such, dogs with anaplastic MCT remain a frustrating undertaking of survival time and quality of life. Therefore, it is necessary to have better understanding of novel, effective drugs for control of MCT. With the dramatically development of molecule biology in oncology field, molecular target drugs have been aroused general concern because of their great effect and low side-effect. Especially, molecular target drugs have attained remarkably effect of canine MCT treatment. In the present paper, we emphasized the mechanism and effect of three drugs (Imatinib, Toceranib and Masitinib) which are the most commonly used in America and Europe and targeted to the c-kit gene. At last we showed the drug resistance and preventive measure caused by second mutation of c-kit gene. We hope these could provide references to scientific researchers and small animal clinical practitioners in China.

Key words:canine; mast cell tumor; molecular target drug; c-kit gene

文章编号:1007-5038(2016)02-0080-05

中图分类号:S854.4

文献标识码:A

作者简介：李格宾(1985-)，女，北京人，讲师，博士，主要从事小动物肿瘤学研究。△同等贡献作者 *通讯作者

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金(2015QC011)

收稿日期：2015-06-16