葱白提取物对充血性心力衰竭家兔心室相关电生理指标的影响

吴平亚，李文兴，胡河，陈玉婷，杨增，吴承云

(1.武汉市洪山区张家湾街社区卫生服务中心内科，湖北 武汉 340065；2.武汉大学人民医院心血管研究所，湖北 武汉 430060)

葱白提取物对充血性心力衰竭家兔心室相关电生理指标的影响

吴平亚1，李文兴2，胡河2，陈玉婷2，杨增2，吴承云2

(1.武汉市洪山区张家湾街社区卫生服务中心内科，湖北 武汉 340065；2.武汉大学人民医院心血管研究所，湖北 武汉 430060)

目的探讨葱白提取物(FOB)对充血性心力衰竭(CHF)引起室性心律失常相关电生理的影响。方法健康成年雄性新西兰大耳白兔分为正常对照组(Control组，n=15)、CHF模型组(CHF，n=15)和CHF+FOB干预组(FOB组，n=15)。CHF模型制备经兔耳缘静脉注射异丙肾上腺素(0.3 mg·kg-1·d-1，连续注射3周)诱导，后继续喂养6个月成功完成。利用记录在体心脏左心室单相动作电位（MAP）相关静息膜电位（RMP），动作电位幅度(APA)、最大上升速率(Maxdv/dt)、动作电位复极化恢复10%、20%、50%、90%(APD10、APD20、APD50、APD90)和短阵快速刺激观察心律失常刺激周长(BCL)、诱发率和持续时间在各组变化。酶解法分离单个心室肌细胞，全细胞膜片钳技术观察心室肌细胞L-型钙电流(ICa-L)在用药前后改变。结果与Control组比较，CHF组RMP、APA、Maxdv/dt显著减小，APD10、APD20、APD50和APD90明显延长，并且BCL、诱发率明显增加，持续时间更长(P均＜0.01)；与CHF组比较，FOB组RMP、APA、Maxdv/dt明显增加，各APD显著缩短，且BCL严重缩短，诱发率和持续时间均降低(P均＜0.01)。FOB能明显抑制CHF心室肌细胞ICa-L电流密度(P＜0.01)，当钳制电压为+20 mV时，与Control组比较，CHF组ICa-L电流密度由(7.1±0.3)pA/pF增加为(10.9±0.5）pA/pF(P＜0.01)；当加入FOB作用CHF组心室肌细胞后，ICa-L减小为(6.4± 0.2)pA/pF(P＜0.01)。FOB能使CHF组ICa-L的I-V曲线明显上调，超过Control组。结论FOB能显著改善CHF心室肌电生理易损性和室性心律失常的易感性，起到抗CHF室性心律失常作用。其机制可能与FOB抑制CHF心室肌细胞ICa-L有关。

葱白提取物；心室电生理；充血性心力衰竭；心律失常

充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)患者的心脏常出现电重构，容易被诱发室性心律失常[1]。其机制可能与离子通道表达异常，允许离子电流进出心室肌细胞内外量的多寡密切相关[2]。抗心律失常药物能够有效减少CHF室性心律失常的发生，尤其是一些中成药，越来越在拮抗与调整室性心律失常中发挥着无限能量，受到临床重视[3]。葱白(fistular onion bulb，FOB)提取物具有抗动脉粥样硬化，减轻心肌细胞内[Ca2+]i超载，发挥抗心肌缺血再灌注损伤效应[4]。提示FOB可能有多重功效并可能对L-型钙电流(L-type calcium current，ICa-L)产生一定作用，但有关FOB对CHF室性心律失常的影响报道较少，尤其是否通过作用ICa-L对CHF室性心律失常产生作用的机理还不清楚。本文将制造家兔CHF模型，采用记录单相动作电位(monophasic action potential，MAP)、全细胞膜片钳等技术记录心室相关电生理指标，探讨FOB对CHF室性心律失常的影响和机制，旨在为开发FOB的临床应用前景提供理论实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其分组 健康雄性新西兰大耳白兔45只，购于武汉生物制品研究所，体质量1.5～2.0 kg。饲养于本院实验动物中心(SPF级动物室)，整个饲养过程充分提供动物生活所需要的湿度、温度和光线并自由进食和饮水。1～2周后进行分组及CHF模型制备。实验分为正常对照组(Control组)、CHF模型组(CHF组)和CHF+FOB干扰组(FOB组)，每组15只。

1.2 主要实验仪器设备 超声仪(Vivid 7，美国GE公司)；电生理记录系统(PowerLab 16/30，澳大利亚AD公司)；记录和分析模块(LabChart Pro V7，澳大利亚AD公司)；倒置显微镜(IX70-122，Olympus，日本)；Pulse+Pulsefit软件(Version8.31，HEKA，德国)；EPC-9放大器(HEKA，德国)。

1.3 主要实验溶液及试剂 Tyrode液(mmol/L)：氯化钠(NaCl)135.0、氯化钾(KCl)5.4、氯化镁(MgCl2) 1.0、Hepes缓冲液10.0、葡萄糖(Glucose)10.0，pH用氢氧化钠(NaOH)调至7.35。ICa-L细胞外液(mmol/L)：氯化铯(CsCl)5.4，MgCl21，Glucose 11，pH用氢氧化铯(CsOH)调至7.4；ICa-L细胞内液(mmol/L)：NaCl 5，Hepes缓冲液5，(Mg-ATP)2.5，pH用CsOH调至7.4。FOB提取物由华中科技大学同济医学院药理学实验室提供，参照前期FOB对心肌缺血再灌注影响结果，本次实验选择浓度为50 g/L。除常规NaCl、KCl等试剂为国产外，其他试剂均为美国Sigama公司产品。

1.4 方法

1.4.1 CHF模型的制备 参照文献并做改良[5]，经兔耳缘静脉注射异丙肾上腺素，0.3 mg·kg-1·d-1，连续不间断注射3周，注射前后注意剃毛、消毒和止血；FOB组是在CHF模型完成后加药；对照组动物注射相同体积0.9%生理盐水并作同样对待，造模后继续喂养6个月，并通过观察临床表现，超声心动图和心电图检查，判断CHF动物模型成功。超声和心电图都是由副教授职称专科医师完成，其结果：当CHF组兔出现消瘦、食欲减退、嗜睡、气促和肌肉萎缩等临床症状；与Control组比较，CHF组兔射血分数值减小[(63.68±18.56)%vs (91.37±23.71)%，P＜0.05]，左心室腔明显扩大，室间隔变薄，短轴缩短率降为37.93%；心电图上出现室性早搏，与Control组比较，CHF组兔心率降低[(209.70±16.45)次/min vs(251.45±27.12)次/min，P＜0.05]，QT间期延长[(169.62±24.20)ms vs(131.42±30.50)ms，P＜0.05]。与相关报道[6]结果一致，预示造模成功。

1.4.2 在体左心室MAP记录 各组兔接受耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉(300 mg/kg)后开胸，用开睑器撑开胸廓充分暴露心脏，小心剪开心包膜，用接触式双极铂金微电极记录自律心率下左心室前壁靠近心尖部MAP。主要参数包括静息膜电位(RMP)、动作电位幅度(APA)、动作电位最大上升速率(Maxdv/dt)、动作电位复极化恢复到10%、20%、50%、90%时程(APD10、APD20、APD50、APD90)。

1.4.3 短阵快速刺激诱发室性心律失常记录 室性心律失常诱发是在上述电生理记录完成后经过30 min(消除心脏记忆对后续实验数据影响)再进行，方法采用短阵快速刺激法(burst-pacing)，刺激波宽2 ms，刺激周长从200 ms到20 ms，每次持续时间10 s，观察各组兔被诱发室性心律失常情况，包括室性早搏、室性心动过速或心室颤动，诱发室性心律失常的刺激周长(BCL)，诱发率和持续时间。FOB组实验过程是在上述实验记录完CHF组数据后，间隔30 min以消除心脏记忆对后续实验数据影响，再给CHF兔静滴FOB注射液20 min，之后维持静滴并记录上述各项电生理指标。

1.4.4 心室肌细胞的分离 经兔耳缘静脉注射肝素钠(500 IU/Kg)抗凝，10 min后剪下心脏插入主动脉套管，连接到离体心脏循环灌流装置上灌流，先用无Ca2+的Tyrode液，后改用含Ⅰ型胶原酶、蛋白酶E和小牛血清白蛋白无Ca2+Tyrode液灌流15 min。取下心脏去除心房肌、乳头肌和浦肯野纤维等组织，留取心室肌剪碎、振荡和孵育得到单个心室肌细胞悬液，贴上标签供膜片钳实验实用。

1.4.5 心室肌细胞ICa-L及电流-电压曲线(I-V)记录 将各组分离心室肌细胞悬液加于到显微镜载物台上的细胞记录槽中，等细胞静置贴壁，用ICa-L细胞外液循环灌流10 min。在膜片钳软件控制下，指令程序和记录信号经放大器、电极内液和玻璃微电极与细胞高阻抗封接，形成全细胞膜片钳记录模式。设置钳制电压-40 mV，指令电位由-40 mV去极化到+60 mV，跃阶10 mV，持续时间200 ms，可记录一缓慢的内向电流，此电流能被钙通道阻滞剂维拉帕米(20 μmol/L)阻断，表明此电流为ICa-L。FOB组ICa-L记录是在分离CHF心室肌细胞后，给予加有50 mg/L的FOB细胞外液灌流CHF心室肌细胞10 min，再重复上述实验过程。为消除每个细胞大小对统计结果造成误差，电流单位用电流密度(pA/pF)表示。以各自指令电位为横坐标，对应电流密度为纵坐标绘制ICa-L的I-V曲线。

1.5 统计学方法 统计分析用Origin6.0软件，计量数据符合正态分布和方差齐性以均数±标准差(±s)表示，多组数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用t检验；计数资料以率/百分比表示，两组间率的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组白兔心室肌MAP相关参数比较 与Control组比较，RMP、APA和Maxdv/dt在CHF组显著减小，APD10、APD20、APD50和APD90明显延长(P均＜0.01)；在FOB的作用下，CHF组RMP、APA和Maxdv/dt各值又得到显著增加，APD10、APD20、APD50和APD90明显缩短，各值均接近Control组相应各观察值(P均＜0.01)，见表1。

表1 三组白兔心室肌MAP参数比较(±s)

表1 三组白兔心室肌MAP参数比较(±s)

注：与Control组比较，aP＜0.01；与CHF组比较，bP＜0.01。

组别Control组CHF组FOB组F值P值APD90(ms) 168.90±28.94 203.52±16.27a158.19±18.42b170.21 0.002只数15 15 15 RMP(mV) -23.91±3.85 -14.36±6.09a-19.93±7.57b101.031 0.020 APA(mV) 46.93±6.17 35.89±7.94a45.38±8.83b67.82 0.010 Maxdv/dt(mV/s) 5571.02±491.68 3334.90±505.56a4598.36±128.89b109.74 0.020 APD10(ms) 47.56±10.18 61.82±12.74a49.39±11.15b72.36 0.010 APD20(ms) 60.10±10.25 121.76±18.37a56.67±14.64b52.89 0.005 APD50(ms) 123.14±20.78 169.93±17.69a110.64±15.91b86.63 0.001

2.2 三组心室肌诱发室性心律失常相关参数比较 与Control组比较，CHF组BCL值明显延长，诱发率和持续时间均明显增加(χ2=9.34、10.37、8.95，P均＜0.01)；与CHF组比较，FOB组BCL显著缩短，诱发率和持续时间明显降低(χ2=14.21、7.59、9.65，P均＜0.01)，见表2。

2.3 三组白兔心室肌细胞ICa-L及I-V曲线 在CHF组，室肌细胞ICa-L在各钳制电压下均明显增加，当钳制电压为+20 mV时，与Control组比较，ICa-L增加更趋严重(P＜0.01)；当加入FOB作用CHF组心室肌细胞后，ICa-L在各钳制电压下均显著减小，且在钳制电压为+20 mV时，与CHF和Control组比较，ICa-L减小程度更重(P均＜0.01)。与Control组相比，CHF组ICa-L的I-V曲线明显下移，FOB组ICa-L的I-V曲线明显上抬。各组ICa-L的I-V曲线的形态和方向没有发生改变，见图1。

表2 三组白兔心室肌诱发室性心律失常指标和记录细胞ICa-L比较(±s)

表2 三组白兔心室肌诱发室性心律失常指标和记录细胞ICa-L比较(±s)

注：与Control组比较，aP＜0.01；与CHF组比较，bP＜0.01。

组别 只数 诱发心律失常的BCL(ms)心律失常诱发率(%)心律失常持续时间(%) ICa-L(pA/pF) Control组CHF组FOB组χ2/F值P值15 15 15 63.78±13.85 152.42±19.91a85.25±15.41b10.79＜0.05 1(10.00) 7(70.00)a2(20.00)b21.36＜0.05无反应9(90.00) 3(30.00)a8(80.00)b7.90＜0.05＜10 s 1(10.00) 4(40.00)a1(10.00)b14.94＜0.05 10～30 s 0(0) 2(20.00)a1(10.00)b20.05＜0.05＞30 s 0(0) 1(10.00)a0(0) 9.27＜0.05 7.19±0.37 10.91±0.56a6.43±0.28b18.63＜0.001

图1 三组白兔心室肌细胞ICa-L及I-V曲线

3 讨 论

本研究结果提示CHF心室肌电活动发生了明显改变，表现在动作电位幅度降低，自动除极放缓，舒张速率低平、延长，复极化过程中各时间段均显著延长，这些电生理改变说明CHF引起了动作电位恢复减慢，心脏传导心电冲动减弱，尽管有APD延长，看似能让心脏有充足时间增加回心血量和心输出量，但因为动作电位静息电位和动作电位最大上升速率均降低，这种心搏输出量是短暂、脆弱的，同时，让出了更多时间为折返性心律失常中碎波发生和传递提供了途径，为异位搏动占主导地位增加机会。因此，CHF发生后，心室肌电生理特征性表现出明显常电重构[7]，造成CHF心脏对室性心律失常的发生具有易感性和易损性，这在本实验中得到证实，CHF兔心脏在程控和短阵快速刺激下，诱发室性心律失常的刺激周长显著延长，诱发率明显增加，失常持续时间延长，明显利于心室心律失常发生。

面对CHF心脏容易被诱发室性心律失常造成患者猝死风险，针对性药物治疗非常关键[8]。研发安全有效的抗心律失常中成药正在成为临床上重要的选择。FOB作为传统的通阳中药，在作用CHF心室肌之后，CHF心室肌电生理发生了显著改善，APA增加，Maxdv/dt增快，APD显著缩短，说明FOB可增加CHF心室动作电位传导速度和心率，增加CHF心脏的心输出量和做功动能，促使心肌收缩增强，心脏电活动更趋稳定，没有给异位起搏点发放冲动预留时间和机会，防止折返性室性心律失常形成所需的条件和途径，改善了CHF心肌电活动紊乱诱发的室性心律失常[9]。FOB这种有益于CHF心脏电活动稳定性特征使得诱发CHF室性心律失常的BCL显著缩短，诱发率明显下降和持续时间变短。表明FOB能够降低诱发CHF室性心律失常的敏感性阈值，使受伤心脏的异常电活动得到重新改变，抗额外快速刺激的耐受性更强，显示FOB具有抗CHF室性心律失常作用[10]。

ICa-L在细胞内外Ca2+运作中起着中心环节，是决定动作电位平台期形成的主要通道，其开启和关闭调控着动作电位传导快慢和生理性[Ca2+]i变化[11]。当CHF心脏做功能力下降，电活动减弱，动作电位传导减慢时，提示CHF心室肌细胞ICa-L可能发生了严重改变，而CHF诱发室性心律失常的机制主要表现在心肌细胞的外向电流下调和/或内向电流上调，尤其是决定动作电位平台期和传递时间ICa-L上调起着关键作用[12]。本实验发现CHF心室肌细胞ICa-L显著增加，I-V曲线严重下移，说明CHF心室肌细胞外Ca2+通过ICa-L进入细胞内增加，诱发Ca2+触发Ca2+释放(Ca2+-induced Ca2+release，CICR)的连锁反应，引起钙超载，从而诱发早期和/或晚期后除极以及触发活动发生，产生室性心律失常[13]。因此，减小CHF心室肌细胞ICa-L，抑制过多的Ca2+进入胞浆，让细胞内[Ca2+]i达到再平衡，可能起到抗CHF室性心律失常作用。FOB可以显著减小CHF心室肌细胞的ICa-L，上移I-V曲线，甚至低于正常对照组。提示CHF心室肌细胞上ICa-L经过FOB作用后，不仅使钙泵开放数量减少，而且在开放状态变得缓慢，缓解了细胞外Ca2+快速通过ICa-L进入心室肌细胞，防治胞浆中[Ca2+]i增高，从而避免了CHF引起的触发性室性心律失常的发生。这也可能是FOB能治疗CHF室性心律失常的电生理机制。

总之，本实验结果表明FOB能显著缩短APD，加快心率，增加心功能，降低需要诱发室性心律失常刺激周长，诱发率和持续时间，其机制可能与FOB能显著抑制CHF心肌细胞的ICa-L有关，其结果可为FOB在临床中广泛应用提供实验依据。

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Effect of fistular onion bulb extract on correlated electrophysiological parameters of ventricular arrhythmias induced by congestive heart failure in rabbit.

WU Ping-ya1,LI Wen-xing2,HU He2,CHEN Yu-ting2,TANG Zheng2, WU Cheng-yun2.1.Department of Cardiology,Hongshan District Zhangjiawan Street Community Health Service Centre, Wuhan 430065,Hubei,CHINA;2.Cardiovascular Research Institute of Wuhan University Renmin Hospital,Wuhan 430060, Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of fistular onion bulb extract(FOB)on correlated electrophysiological parameters of ventricular arrhythmias induced by congestive heart failure(CHF)in rabbits.MethodsThe male New Zealand rabbits were divide into control group(n=5,healthy rabbits),CHF group(n=5,CHF rabbit models) and CHF+FOB group(n=5,CHF rabbit models treated with FOB).The CHF models were induced by injection of isoproterenol(0.3 mg·kg-1·d-1for 3 weeks)after 6 months.The main cardioelectrophysiological parameters such as rest membrane potential(RMP),action potential amplitude(APA),maximum upstroke velocity(Maxdv/dt),action potential duration of 10%,20%,50%and 90%(APD10,APD20,APD50,APD90),as well as basic cycle length(BCL),induced rate and time of ventricular arrhythmias were tested by recording monophasic action potential(MAP)with burst-pacing in rabbits in vivo.The L-type calcium current(ICa-L)was recorded via whole-cell patch clamp technique in enzymatically dissociated single rabbit ventricular myocytes.ResultsCompared with control group,CHF group showed significantly decreased RMP,APA,Maxdv/dt,and longer APD10,APD20,APD50,APD90,as well as increased BCL,induced rate and time of ventricular arrhythmias(all P＜0.01).Compared with CHF group,CHF+FOB group showed significantly increased RMP,APA and Maxdv/dt,shortened APD10,APD20,APD50,APD90,and decreased BCL,induced rate and time of ventricular arrhythmias(all P＜0.01).With voltage clamp model,FOB could markedly decrease the current density of ICa-L,and alter down of current-voltage(I-V)relationship curve in different command potential in CHF ventricular myocytes.When command potential was+20 mV,the current densities of ICa-Lwere significantly increased from(7.1±0.3)pA/pF in control group to(10.9±0.35)pA/pF in CHF group,and decreased to(6.4±0.2)pA/pF in CHF+FOB group(all P＜0.01).ConclusionFOB could significantly improve electrophysiological parameters and decrease the susceptibility of ventricular arrhythmias induced by CHF,which was contributed to anti-ventricular arrhythmias induced by CHF.It is suggested that the mechanisms might attribute to that FOB could markedly inhibit ICa-Lin CHF rabbits.

Fistular onion bulb extract;Ventricular electrophysiology;Congestive heart failure;Ventricular arrhythmias

R-332

A

1003—6350（2016）24—3961—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.24.002

2016-06-29)