靶向siRNA阻断Wnt/β-catenin信号通路对子宫内膜异位症患者在位子宫内膜基质细胞VEGF、MMP-9表达的影响*

刘儒彪，　刘　义，　于　岚，　郑婷婷，　王　罡

华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉　430022



靶向siRNA阻断Wnt/β-catenin信号通路对子宫内膜异位症患者在位子宫内膜基质细胞VEGF、MMP-9表达的影响*

刘儒彪，刘义△，于岚，郑婷婷，王罡

华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉430022

摘要：目的通过观察人子宫内膜异位症在位子宫内膜基质细胞β-catenin的表达，及利用siRNA靶向沉默β-catenin基因以阻断Wnt/β-catenin信号通路来观察其下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)表达的变化，探讨Wnt/β-catenin信号通路在子宫内膜异位症发生机制中的作用。方法采用随机、对照设计，将体外分离、培养的24例子宫内膜异位症患者在位子宫内膜基质细胞分成3组(n=8)：空白组、阴性组(以含阴性荧光siRNA 100 pmol和转染试剂5 μg的混合物转染)以及siRNA干扰组(以含β-catenin siRNA 100 pmol和转染试剂5 μg的混合物转染)，并以10例非子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞作为正常组。利用Real-time PCR和Western blot方法分别检测子宫内膜异位症在位子宫内膜空白组和非子宫内膜异位症正常组β-catenin的表达。转染24 h后，用以上方法分别检测子宫内膜异位症空白组、阴性组和siRNA干扰组β-catenin、VEGF以及MMP-9的表达。结果子宫内膜异位症空白组β-catenin mRNA和蛋白的表达明显高于非子宫内膜异位症正常组(均P<0.05)。子宫内膜异位症siRNA干扰组β-catenin、VEGF以及MMP-9 mRNA和蛋白的表达明显低于空白组和阴性组(均P<0.05)，而空白组与阴性组之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论子宫内膜异位症在位子宫内膜基质细胞β-catenin的表达明显高于非子宫内膜异位症患者，阻断Wnt/β-catenin信号通路后，其下游靶基因VEGF、MMP-9的表达明显受到抑制。因此，Wnt/β-catenin信号通路可能在子宫内膜异位症的发生机制中起重要作用。

关键词：子宫内膜异位症；Wnt/β-catenin信号通路；siRNA；β-catenin；VEGF；MMP-9

子宫内膜异位症(简称内异症)是一种雌激素依赖的良性妇科疾病，以功能性的子宫内膜种植于子宫腔外为特征，并对激素的刺激具有反应性，可引起盆腔痛、痛经和不孕等症状[1-3]，是育龄妇女的常见病、多发病。虽然经血逆流种植理论在内异症的发生机制中被广泛接受，但不能解释90%的生育女性出现经血逆流却仅有3.7%的女性罹患内异症[4-5]，提示子宫内膜异位的粘附、侵袭机制才是内异症发病的关键[6]。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在各种肿瘤的发生中起重要作用[7]。本研究通过体外分离培养内异症患者在位子宫内膜与非内异症患者子宫内膜，比较两者β-catenin在表达上的差异；并利用siRNA靶向沉默内异症患者在位子宫内膜β-catenin基因以阻断Wnt/β-catenin信号通路，观察对其下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)表达的影响；从而探讨Wnt/β-catenin信号通路在子宫内膜异位症发生机制中的作用。

1材料与方法

1.1临床资料

选取2008年10月至2010年1月期间，因内异症于武汉协和医院行手术治疗并经病理证实为内异症患者24例，平均年龄(32.9±6.1)岁，根据转染siRNA的不同随机分成空白组(无siRNA)、阴性组(β-catenin阴性siRNA)和干扰组(β-catenin siRNA)3组(n=8)。选取同期非内异症致不孕在我院门诊行诊断性刮宫患者10例，平均年龄(30.3±4.2)岁，作为正常组。两组患者月经周期规则，且术前3个月内均无激素类药物治疗史。本研究经华中科技大学协和医院伦理委员会批准，内膜标本提供者均知情同意。

1.2标本处理

内异症子宫切除术患者，术后即切开子宫刮取子宫内膜；腹腔镜手术患者，术后即行刮宫术，刮取子宫内膜；非内异症患者于门诊行诊断性刮宫术，刮取子宫内膜。将获得的内膜组织均在无菌条件下置于含双抗(青霉素、链霉素各100 U/mL)的预冷的PBS液中，立即在超净工作台进行子宫内膜间质细胞的原代培养。

1.3实验试剂

PBS液和培养液DMEM/F12(Hyclone，美国)，青霉素、链霉素和胎牛血清(Gbico，美国)，Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶(Roche，瑞士)；羊抗人β-波形单克隆抗体，羊抗人β-catenin单克隆抗体，羊抗人VEGF单克隆及羊抗人MMP-9单克隆抗体(R&D，美国)，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶标鼠抗羊二抗(博士德，武汉)；β-catenin siRNA、阴性荧光siRNA及转染试剂脂质体Lip2000(Santa Cruz，德国)；Trizol试剂盒(Bioflux，日本)，RT试剂盒及SYBR Green realtime PCR master mix-plus(Toyobo，日本)，引物均由美国Invitrogen公司合成；考马斯亮蓝G250试剂盒和ECL发光试剂盒(Pierce Chemical，美国)。

1.4主要仪器

超净工作台，离心机，倒置显微镜，荧光显微镜，PCR仪，Real-time PCR检测系统(Hongshi，中国)。

1.5子宫内膜基质细胞的分离与培养

参照Mylonas等[8]和Tsai等[9]的方法并在实践中不断加以改良：将获得的内膜组织在无菌超净工作台内用含有双抗(青霉素、链霉素各100 U/mL)的PBS液中清洗3遍，以去除血凝块，剪成大小约1 mm×1 mm×1 mm的碎片(肉眼呈糊状)，然后用0.1%的Ⅱ型胶原酶在37℃孵箱中消化30~60 min，并间断振荡，肉眼见内膜组织呈絮状，用含胎牛血清的培养液终止酶作用。吸取上清经200目的尼龙网过滤，滤过液1 500 r/min离心5 min。将剩余组织重复消化10~15 min并过滤，方法同上。弃上清，沉淀悬于DMEM/F12培养液中，再经400目尼龙网过滤。滤过液1 200 r/min离心8 min，弃上清，向沉淀物中加入含双抗(青霉素、链霉素各100 U/mL)和10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液混匀，分别种于数个无菌培养瓶中，并加上述培养液将细胞稀释至约1×105/mL，在37℃、5%CO2的孵箱中培养，隔日换液。待原代培养的细胞铺满瓶壁的85%~90%时可进行传代。弃去培养液，用含双抗(青霉素、链霉素各100 U/mL)的PBS液漂洗2遍，加入0.25%的胰蛋白酶在37℃孵箱中消化3 min左右，显微镜下见细胞收缩变圆时，用含胎牛血清的培养液终止胰酶作用。用吸管将细胞从瓶壁吹打下来，细胞悬液1 200 r/min离心8 min，弃上清，沉淀悬于上述培养液中，分别种于3瓶培养。

1.6子宫内膜基质细胞的鉴定

细胞角蛋白(cytokeratin)广泛存在于人上皮组织及上皮细胞内，而波形蛋白(vimentin)则主要位于人间质细胞中[10]。因此，取对数生长期细胞，消化接种于预先放置有盖玻片的6孔板中，待细胞接近生长成单层后，取出盖玻片，PBS洗涤3次；4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗涤3次；以含0.3%H2O2的甲醛溶液封闭内源性过氧化物酶，室温20 min，PBS洗涤3次；加入羊抗人β-波形单克隆抗体，37℃孵育2 h，转入4℃放置过夜，PBS洗涤3次；SP法染色，用PBS液替代第一抗体作阴性对照。

1.7β-catenin siRNA的瞬时转染

转染前1 d，将细胞以2×105/孔的密度消化接种于6孔板中，在37℃、5%CO2的孵箱中培养18 h左右，细胞铺满孔板60%~80%时用于转染。转染按生产商提供的实验指导进行。将含阴性荧光siRNA 100 pmol的siRNA转染培养液400 μL，与含脂质体Lip2000 5 μg的siRNA转染培养液400 μL混匀静置20 min制备成转染复合物；将转染复合物加入用转染培养液漂洗过的铺满细胞的6孔板中；然后置6孔板于37℃、5%CO2的孵箱中培养5~7 h，更换含双抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养18~24 h；荧光显微镜下观察，并计算其转染率。β-catenin siRNA组转染方法同上。

1.8总RNA的提取和Real-time PCR检测

Trizol试剂盒一步法提取内膜基质细胞的总RNA，按RT试剂盒逆转录获得cDNA。登录GenBank数据库获得人类β-catenin、VEGF、MMP-9基因以及内参β-actin基因，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物，见表1。

表1　β-catenin、VEGF、MMP-9及β-actin基因的引物序列

引物反应体系为cDNA样本(10倍稀释)2 μL，上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，SYBR Green mix 12.5 μL，加Taq聚合酶2.5 μL，再加ddH2O补至25 μL的总体积。反应条件为95℃ 2 min变性后，再接95℃ 15 s、退火(58.5℃、54℃、59℃及59℃)1 min、72℃ 30 s，共40个循环后72℃延伸10 min。采用SLAN公司的Real-time PCR检测系统对扩增后的PCR产物进行荧光定量检测，生成定量标准曲线图。

1.9免疫印迹法(Western blot)

取非内异症内膜基质细胞和3组内异症在位子宫内膜基质细胞，弃培养液，用PBS液反复漂洗3遍，然后加入预冷的细胞裂解缓冲液(50 mmol/L Tris·HCl pH 7.4、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、1%TritonX-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS)，在冰上裂解30 min，并间断振摇，以12 000 r/min 4℃离心5 min。取上清，分别用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。各取50 μg蛋白样品进行电泳、转膜、封闭，分别加β-catenin、VEGF和MMP-9单克隆抗体4℃孵育过夜，室温下脱色摇床上洗涤3次，每次10 min；加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶标鼠抗羊二抗，室温孵育1~2 h，室温下脱色摇床上洗涤2次，每次10 min；用ECL发光试剂盒进行化学发光反应，在X线胶片上进行曝光、显影、定影，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的吸光度值(A)。

1.10统计学处理

2结果

2.1子宫内膜基质细胞的分离与鉴定

在倒置显微镜下观察，新分离的内膜基质细胞大小不一，形态亦不规则，多呈圆形或类圆形。半小时至数小时后，细胞基本贴壁，部分细胞呈多角形或梭形变。培养24 h后，子宫内膜基质细胞全部呈梭形排列，胞质透明，核椭圆(图1)。免疫组化检测结果显示，子宫内膜基质细胞中波形蛋白呈阳性着色(图2)。计数波形蛋白阳性染色的基质细胞数，结果提示，分离得到的子宫内膜细胞纯度为92%左右。

图1　培养24 h子宫内膜基质细胞(×100)Fig.1 Endometrial stromal cells after culture for 24 h(×100)

图2　子宫内膜基质细胞波形蛋白免疫组化染色鉴定(×100)Fig.2 Immunohistochemical staining of vimentin in endometrial stromal cells(×100)

2.2内异症在位子宫内膜和非内异症子宫内膜β-catenin的表达差异

Real-time PCR及Western blot检测结果显示，内异症患者在位子宫内膜基质细胞β-catenin mRNA及蛋白的表达均明显高于正常组子宫内膜基质细胞(图3、4)。

与正常组比较，*P<0.05图3　内异症与正常组子宫内膜基质细胞β-catenin mRNA的表达Fig.3 Expression of β-catenin mRNA in endometrial stromal cells in endometriosis and control groups

与正常组比较，*P<0.05图4　内异症与正常组子宫内膜基质细胞β-catenin蛋白的表达Fig.4 Expression of β-catenin protein in endometrial stromal cells in endometriosis and control groups

2.3β-catenin siRNA细胞转染及效率

用荧光标记的β-catenin siRNA进行细胞转染后，继续培养18~24 h，荧光显微镜下观察细胞形态。明视野见内异症在位子宫内膜基质细胞呈多角形或梭形；荧光视野见细胞呈现绿色荧光，细胞呈多角形或梭形，胞质颜色较淡，胞核呈椭圆形，边界清晰，颜色稍深；周围可见散在非特异性绿色荧光点(图5)。计数荧光视野细胞数，与明视野细胞数相比，结果提示细胞转染率为70%左右。

A：明视野；B：荧光视野图5　荧光标记的β-catenin siRNA转染后荧光显微镜下所见在位子宫内膜基质细胞(×100)Fig.5 Fluorescence microscopy of endometrial stromal cells after transfection with β-catenin siRNA labeled with fluorescence(×100)

2.4靶向沉默β-catenin基因对内异症在位子宫内膜β-catenin及VEGF、MMP-9表达的影响

Real-time PCR及Western blot检测结果显示，内异症患者干扰组在位子宫内膜基质细胞β-catenin、MMP-9和VEGF mRNA及蛋白的表达明显低于内异症空白组和阴性组；而内异症空白组与阴性组两组之间β-catenin、MMP-9和VEGF mRNA及蛋白的表达差异无统计学意义(均P>0.05)(图6、7)。

与干扰组比较，*P<0.05图6　内异症患者干扰组、空白组和阴性组β-catenin、MMP-9和VEGF mRNA的表达Fig.6 Expression of β-catenin，MMP-9 and VEGF mRNA in endometrial stromal cells in siRNA interference，blank and negative groups

3讨论

Wnt信号通路是调控细胞生长、发育、分化的关键途径，是目前已知的胚胎发育所必须的信号转导途径，并在肿瘤的发生发展中占有重要地位[11]。经典的Wnt/β-catenin信号通路是细胞外Wnts蛋白与两类跨膜蛋白受体：一类是七次跨膜的卷曲蛋白(frizzled protein，Fz)家族成员，另一类是低密度脂蛋白受体相关蛋白家族(lipoprotein receptor related proteins，LRP)的成员LRP5/6相结合后，在LRP5/6的协同下经Fz将信号转导给胞质内的散乱蛋白(dishevelled，Dsh)，使其募集至胞膜下，Dsh通过抑制糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)的活性从而抑制β-catenin的磷酸化，使β-catenin稳定，大量的β-catenin转移至核内，与核内T细胞因子(TCF/LEF)家族转录因子相互作用，激活靶基因(如：cyclinD1、c-myc、VEGF和MMP-7)的表达[12-14]。近几年来有研究表明，Wnt信号通路在雌性哺乳动物生殖系统的发育中起重要作用。人子宫内膜基质细胞也特征性表达了Wnts蛋白，并在雌、孕激素的调节下参与子宫内膜的发育、分化和胚胎着床等生理过程[15-16]。

与干扰组比较，*P<0.05图7　内异症患者干扰组、空白组和阴性组β-catenin、MMP-9和VEGF蛋白的表达Fig.7 Expression of β-catenin，MMP-9 and VEGF protein in endometrial stromal cells in siRNA interference，blank and negative groups

关于内异症的发病机制众说纷纭，长期以来以经血逆流种植理论占主导地位，但不能解释90%的生育女性出现经血逆流却仅有3.7%的女性罹患内异症[4-5]。同时，大量研究发现内异症患者和非内异症患者的在位子宫内膜在分子和生物学特质上就有差异，并提出了在位子宫内膜的生物化学、分子生物学、遗传学等特质对其逆流至异地后的“命运”起决定作用，即“在位内膜决定论”[17]。而在位内膜通过什么机制促进了其逆流至异地的粘附与侵袭作用呢？目前尚无定论。众所周知，内异症虽为良性疾病，却具有类似恶性肿瘤远处转移和种植生长能力。国内学者郎景和[18]经过近十年的基础研究，聚焦子宫在位内膜，发现内异症患者的在位内膜在组织形态和超微结构方面具有更活跃的功能、更强的血管增生、迁徙和侵袭能力。大量的分子生物学、蛋白组学和动物模型的研究结果也显示，与正常子宫内膜相比，内异症患者的在位子宫内膜在血管生成、细胞侵袭转移、以及凋亡等方面存在很多基因差异及蛋白表达异常，如VEGF，MMP-9等的表达均明显增强。故具有内在差异的在位子宫内膜是内异症形成中的决定因素，而经血逆流只是实现从该潜能到发病的桥梁。

研究表明，粘附、侵袭、血管生成(attachment-aggrassion-angiogenesis，3A)是在位内膜细胞异位种植形成内异症的基本病理生理过程[19]。这一过程也可清晰地描述和解释内异症的临床病理表现。内异症虽为良性疾病，但其主要的生物学特征是异位内膜的侵袭性生长和转移，极易复发，类似于恶性肿瘤；根据生命活动的相似性，推测内异症在发病机制方面与恶性肿瘤存在某些共同之处。近年来，大量的研究发现在结肠直肠癌中广泛存在Wnt信号通路的过度激活[20]，这一变化并非仅仅局限于胃肠组织起源的肿瘤，在子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌和一些间叶细胞起源的肿瘤中也发现有β-catenin、APC以及Axin等信号分子的突变[21]。本研究就是试图证明Wnt/β-catenin信号通路是否参与了内异症在位内膜异位种植的病理过程。Gaetje等[22-23]通过Real-time PCR和原位杂交技术证实，内异症患者异位病灶Wnt-7a的表达明显高于在位内膜和非内异症患者的子宫内膜；Wu等[24]应用LCM和基因芯片技术检测到Wnt信号分子在异位病灶表达明显增高；van Patten等[25]通过免疫组化的方法显示结肠子宫内膜异位症患者异位病灶β-catenin的表达明显高于正常增生期子宫内膜；Gorbacheva等[26]也用免疫组化的方法证明腺肌症患者异位内膜和在位内膜β-catenin的表达明显高于正常子宫内膜；还有研究证明[27-28]，MMP-9、VEGF等在内异症患者在位内膜的表达明显高于正常组子宫内膜，而Wnt/β-catenin信号通路的激活可明显上调MMPs和VEGF的表达[29-32]；均提示Wnt/β-catenin信号通路可能参与了内异症的发生与发展。β-catenin是调节Wnt/β-catenin信号通路的关键效应分子，当β-catenin蛋白水平低下时，Wnt/β-catenin信号通路关闭；反之，Wnt/β-catenin信号通路开启[17]。本研究通过体外培养非内异症子宫内膜基质细胞和内异症在位内膜基质细胞，发现内异症在位内膜基质细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin的表达与正常组比较，存在明显差异。Real-time PCR和Western blot检测结果显示，在位内膜基质细胞β-catenin的mRNA和蛋白水平均高于正常组(均P<0.05)。证明Wnt/β-catenin信号通路可能参与了内异症在位内膜细胞异位种植。利用siRNA载体介导的RNA干扰技术转染内异症在位内膜基质细胞，靶向沉默β-catenin以阻断Wnt/β-catenin信号通路后，发现在位内膜基质细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin及下游靶基因VEGF、MMP-9的表达明显受抑制。Real-time PCR和Western blot结果显示，干扰组β-catenin及VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白水平均低于空白组和阴性组(均P<0.05)，而空白组与阴性组β-catenin及VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白水平无明显差异(均P>0.05)。这一结果进一步证明，通过抑制Wnt/β-catenin信号通路关键效应分子β-catenin的表达可下调其下游靶基因VEGF、MMP-9的表达，从而阻断异位内膜的异地侵袭和种植。因此，我们可以推断，子宫内膜基质细胞Wnt/β-catenin信号通路的某一信号分子异常致β-catenin在胞质中累积，继而进入胞核内激活TCF/LEF转录因子，启动下游靶基因VEGF、MMP-9的转录与翻译，从而促进子宫内膜细胞随逆流的经血在异地种植及侵袭、转移和血管生成而导致内异症的形成与发展。其发病机制是否的确如此，还有待进一步研究。

参考文献

[1]Kuligowska E，Deeds L，Lu K.Pelvic pain：overlooked and underdiagnosed gynecologic conditions[J].Radiographics，2005，25(1)：3-20.

[2]Ulukus M，Cakmak H，Arici A.The role of endometrium in endometriosis[J].J Soc Gynecol Investig，2006，13(7)：467-476.

[3]Pitsos M，Kanakas N.The role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of endometriosis[J].Reprod Sci，2009，16(8)：717-726.

[4]Halme J，Hammand M G，Hulka J F，et al.Retrograde menstruation in healthy women and in patients with endometriosis[J].Obstet Gynecol，1984，64(2)：151-154.

[5]Sangi-Haghpeykar H，Poindexter A N.Epidemiology of endometriosis among parous women[J].Obstet Gynecol，1995，85(6)：983-992.

[6]Gzvani R，Templeton A.New consideration for the pathogenesis of endometriosis[J].Obstet Gynecol，2002，76(2)：117.

[7]Dihlmann S，von Knebel Doeberitz M.Wnt/beta-catenin pathway as a molecular target for future anti-cancer therapeutics[J].Int J Cancer，2005，113(4)：515-524.

[8]Mylonas I，Speer R，Makovitzky J，et al.Immunohistochemical analysis of steriod receptors and glycodelin A(PP14)in isolated glandular epithelial cells of normal human endometrium[J].Histochem Cell Biol，2000，114(5)：405-411.

[9]Tsai S J，Wu M H，Lin C C，et al.Regulation of steroidogenic acute regulatory protein expression and progesterone production in endometriotic stromal cells[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86(12)：5765-5773.

[10]Matthews C J，Redfern C P，Hirst B H，et al.Characterization of human purified epithelial and stromal cells from endometrium and endometriosis in tissue culture[J].Fertil Steril，1992，57(5)：990-997.

[11]Reya T，Clevers H.Wnt signalling in stem cells and cancer[J].Nature，2005，434(7035)：843-850.

[12]Moon R T,Kohn A D,De Ferrari G V,et al.Wnt and beta-catenin signaling：Diseases and therapies[J].Nat Rev Genet，2004，5(9)：689-699.

[13]Li Y J，Wei Z M，Meng Y X，et al.Beta-catenin up-regulates the expression of cyclin D1，c-myc and MMP-7 in human pancreatic cancer：relationships with carcinogenesis and metastasis[J].World J Gastroenterol，2005，11(14)：2117-2123.

[14]Lustig B，Behrens J.The Wnt signaling pathway and its role in tumor development[J].Cancer Res Clin Oncol，2003，129(4)：199-221.

[15]Carson D D，Lagow E，Thathiah A，et al.Changes in gene expression during the early to mid-luteal(receptive phase)transition in human endometrium detected by high-density microarray screening[J].Mol Hum Reprod，2002，8(9)：871-879.

[16]Tulac S，Nayak N R，Kao L C，et al.Identification，characterization and regulation of the canonical Wnt signaling pathway in human endometrium[J].J Clin Endocrenol Metab，2003，88(8)：3860-3866.

[17]郎景和.子宫内膜异位症的研究与设想[J].中华妇产科杂志，2003，38(8)：478-480.

[18]郎景和.关于子宫内膜异位症的再认识及其意义[J].中国工程科学，2009，11(10)：137-142.

[19]Velasco I，Rueda J，Acien P.Aromatase expression in emdometriotic tissues and cell cultures of patients with endometriosis[J].Mol Hum Reprod，2006，12(6)：377-381.

[20]Thorstensen L，Lind G E，Lovig T，et al.Gentic and epigenetic change of components affecting the Wnt pathway in colorectal carcinomas stratified by microsatellite instability[J].Neoplasia，2005，7(2)：99-108.

[21]Dihlmann S，von Knebel Doeberitz M.Wnt/beta-catenin pathway as a molecular target for future anti-cancer therapeutics[J].Int J Cancer，2005，113(4)：515-524.

[22]Gaetje R，Holtrich U，Karn T，et al.Characterization of Wnt-7a expression in human endometrium and endometriotic lesions[J].Fertil Steril，2007，88(6)：1534-1540.

[23]Gaetje R，Holtrich U，Engels K，et al.Endometriosis may be generated by mimicking the ontogenetic development of the female genital tract[J].Fertil Steril，2007，87(3)：651-656.

[24]Wu Y，Kajdacsy-Balla A，Strawn E，et al.Transcriptional ch-aracterization of differences between eutopic and ectopic endometrium[J].Endocrinol，2006，147(1)：232-246.

[25]van Patten K，Parkash V，Jain D.Cadherin expression in gastrointestinal tract endometriosis：possible role in deep tissue invasion and development of malignancy[J].Mod Pathol，2010，23(1)：38-44.

[26]Gorbacheva I V，Romadanova I A，Solomakhina M A，et al.The specific features of the expression of E-cadherin and beta-catenin in adenomyosis[J].Arkh Patol，2008，70(5)：12-16.

[27]Collette T，Maheux R，Mailbux J，et al.Increased expression of matrix metalloproteinase-9 in the eutopic etrial tissue of women with endometriosis[J].Hum Reprod，2006，21(12)：3059-3067.

[28]Tan X J，Lang J H，Shen K，et al.Expression of vascular endothelial growth factor and thrombospondin1 mRNA in patients with endometriosis[J].Fertil Steril，2003，78(1)：148-153.

[29]陈琛，曾石生，李风波，等.肺子宫内膜异位症1例报道及文献复习[J].华中科技大学学报：医学版，2015，44(6)：745-747.

[30]Hulboy D L，Rudolph L A，Matrisian L M.Matrix metalopproteinase as mediators of reproductive function[J].Mol Hum Reprod，1997,3(1)：27-45.

[31]Huang J C，Papasakelarion C，Dawood M Y.Epidermal gro-wth factor and basic fibroblast growth factor in peritoneal fluid of women with endometriosis[J].Fertil Steril，1996，65(5)：931-934.

[32]赵云霞，马琳，蔡兆根.乳腺癌中VEGF-D/VEGFR-3与淋巴管生成的关系及临床意义探讨[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2015，24(1)：85-89.

(2015-09-09收稿)

Gene Silencing of Wnt/β-catenin Signaling Pathway by siRNA Inhibits VEGF and MMP-9 Expression in Endometrial Stromal Cells in Patients with Endometriosis

Liu Rubiao，Liu Yi△，Yu Lanetal

DepartmentofObstetricsandGynecology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo explore the role of Wnt/β-catenin signal pathway in the pathogenesis of endometriosis by detecting the expression of β-catenin in endometrial stromal cells of the eutopic endometrium of women with endometriosis，and the expression of its down-stream target genes vascular endothelial growth factor(VEGF)and matrix metalloproteinases-9(MMP-9)after silencing β-catenin gene.MethodsEndometrial stromal cells were isolated from the eutopic endometrium of 24 women with endometrisis and culturedinvitro.They were divided into 3 groups at random：blank group(n=8)，negative group(transfection with 100 pmol negative fluorescence-labeled siRNA and 5 μg transfection agent，n=8)and siRNA interference group(transfection with 100 pmol β-catenin-containing siRNA and 5 μg transfection agent，n=8).Endometrial stromal cells from 10 women without endometriosis served as controls.Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression levels of β-catenin in endometrial stromal cells from women with or without endometrisis，and the expression levels of VEGF and MMP-9 24 h after transfection in the three groups.ResultsThe expression levels of β-catenin were significantly higher in endometrisis group than in non-endometrisis group(P<0.05).The expression levels of β-catenin，VEGF and MMP-9 were significantly lower in siRNA interference group than in blank and negative groups(P<0.05).There were no differences between blank and negative groups(P>0.05).Conclusionβ-catenin expression is significantly increased in endometrial stromal cells from the eutopic endometrium of women with endometriosis as compared with those without endometriosis.After blockage of Wnt/β-catenin signal pathway，the expression of VEGF and MMP-9，down-stream target genes of β-catenin，is suppressed dramatically.This study suggests that Wnt/β-catenin signal pathway may play an important role in the pathogenesis of endometriosis.

Key wordsendometriosis；Wnt/β-catenin signal pathway；siRNA；β-catenin；VEGF；MMP-9

中图分类号：R711.71

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.002

通讯作者△，Corresponding author，E-mail：liqun94@163.com

*国家自然科学基金资助项目(No.30750007)

刘儒彪，男，1982年生，博士研究生，E-mail：liurubiao@hotmail.com