CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在抗IL-6单克隆抗体延长小鼠心脏移植物存活中的作用*

雷　钧，　陈磊峰，　刘秀霞，　方　路，　胡俊文，　黄　达，　戈　进，　陈知水

1南昌大学第二附属医院肝胆胰外科，南昌　330006

2华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所，武汉　430030



CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在抗IL-6单克隆抗体延长小鼠心脏移植物存活中的作用*

雷钧1，陈磊峰1，刘秀霞1，方路1，胡俊文1，黄达1，戈进1，陈知水2

1南昌大学第二附属医院肝胆胰外科，南昌330006

2华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所，武汉430030

摘要：目的探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在anti-IL-6 mAb抑制同种异体心脏移植急性排斥反应中的作用及机制。方法构建小鼠心脏移植模型。实验动物随机分为移植模型组、移植对照组(注射rat-IgG)、anti-IL-17 mAb治疗组和anti-IL-6 mAb治疗组。流式细胞术检测各组受鼠移植术后第7天脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例。分别于anti-IL-6 mAb组术后第1、3、5天给予anti-CD25 mAb输注，于术后第7天检测受鼠脾脏及移植心脏CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例，观察移植心脏存活时间并进行组织学检查；Real-time PCR检测anti-CD25 mAb输注后第3、7、10天移植心脏中IFN-γ mRNA的表达情况。使用去增殖的BALB/c或C3H小鼠脾脏淋巴细胞作为刺激细胞，各实验组受鼠移植物来源的淋巴细胞作为反应细胞，行混合淋巴细胞培养检测细胞增殖情况。结果anti-IL-6 mAb组移植术后第7天CD4+CD25+T细胞的比例明显升高，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD3+T细胞的比例表现出同样的趋势，而anti-IL-17 mAb组与移植模型组比较无明显差异。anti-CD25 mAb输注anti-IL-6 mAb组明显缩短了小鼠移植心脏的存活时间(10.6±1.2)d，伴随CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例明显下降，同时移植物中IFN-γ mRNA的转录水平升高。混合淋巴细胞培养结果显示anti-IL-6 mAb组受鼠淋巴细胞经刺激后其细胞增殖程度较rat-IgG对照组、anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb组及移植模型组明显下降，而针对来自第三方C3H小鼠的脾脏淋巴细胞刺激则无此抑制效应。结论anti-IL-6 mAb延长小鼠移植心脏存活可能是通过促进移植小鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的产生而实现的。使用anti-CD25 mAb降低CD4+CD25+T细胞水平抑制了anti-IL-6 mAb的抗排斥效应，并且伴随着移植物中IFN-γ mRNA转录水平的升高。

关键词：急性排斥反应；心脏移植；抗IL-6单克隆抗体；抗CD25单克隆抗体；调节性T细胞；IFN-γ

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)是一群具有免疫抑制功能的细胞，已有大量研究证实Treg细胞在抑制排斥反应、延长移植物存活上发挥着重要的作用，而Foxp3被认为是调控Treg细胞分化的特异性转录因子[1]。

我们前期研究已证实，anti-IL-6 mAb可有效抑制急性排斥反应小鼠体内Th17和Th1细胞的活化，脾脏及移植心脏中IFN-γ和IL-17的比例明显下降[2]，但其作用机制仍有待进一步分析。研究发现IL-6具有抑制Treg细胞分化的作用[3]。Korn等[4]报道IL-6基因缺失的小鼠对自身免疫性脑脊髓炎的病情发生抵抗，小鼠中枢神经系统中效应性T细胞分化明显受到抑制，而Treg细胞数量则显著增加。因此我们设想，在移植排斥反应中anti-IL-6 mAb输注可促进小鼠体内Treg细胞的分化，并且可能是延长小鼠移植心脏存活时间，抑制移植排斥反应发生及下调小鼠体内IFN-γ、IL-17表达的原因之一。

本研究中，我们应用anti-IL-6 mAb、anti-IL-17 mAb分别中和发生急性排斥反应的受鼠体内产生的细胞因子IL-6、IL-17，检测Treg细胞的比例变化，并使用anti-CD25 mAb对Treg细胞进行干预，检测移植物中细胞因子的表达，结合组织病理学检测以探讨Treg细胞在anti-IL-6 mAb延长移植物存活中发挥的作用及可能机制。

1材料与方法

1.1材料和试剂

近交系BALB /c小鼠作为供体，近交系C57小鼠作为供体或受体。C3H、BALB /c、C57小鼠均为雄性，约8周龄，15~20 g，由南昌大学动物实验中心提供。供、受体体重差异无统计学意义，手术前后不禁饮食。

FITC标记的抗CD4、抗CD25单抗，大鼠抗小鼠IL-6、IL-17、CD25单抗，PE标记的抗CD25、抗Foxp3单抗购自BD Bioscience公司；大鼠同型IgG购自Sigma公司；Ionomycin、小鼠淋巴细胞分离液、丝裂霉素购自深圳达科为生物技术有限公司。

1.2实验分组

实验动物随机分为4组，每组各36对。anti-IL-6 mAb组受鼠自手术之日起至术后第6天及随后的第8天和第10天，每次经小鼠尾静脉输注100 μg大鼠抗小鼠IL-6单克隆抗体(anti-IL-6 mAb)；anti-IL-17 mAb组自手术之日起至术后第6天同法每日输注100 μg anti-IL-17 mAb；以同时相点经尾静脉输注等量的大鼠抗小鼠IgG(rat-IgG)及未治疗组作为实验对照。为了进一步研究输注anti-IL-6 mAb延长小鼠移植心脏存活时间与促进Treg细胞分化有关，我们使用anti-CD25 mAb对Treg细胞进行干预，即分别于anti-IL-6 mAb组术后第1、3、5天经小鼠尾静脉注射150 μg的抗CD25单克隆抗体；实验中所用抗体剂量均为我们前期研究所得[2]。

1.3各组受鼠移植心脏平均存活时间

移植当天为术后第0天，术后每日通过视诊和触诊受鼠颈部移植心脏，观察各组小鼠移植心脏存活时间，供心不再搏动即视为排斥终点。

在已进入上市辅导且IPO申请未被受理的395家新三板企业中，辅导期在半年以内的企业共有54家，占比13.67%。也就是说，除已申报和已进入辅导期的新三板企业外，新三板还有数量庞大的IPO后备军。这些企业一部分因为业绩暂时无法IPO，一部分出于新三板政策红利的考虑，则处于观望摇摆阶段。

1.4移植心脏组织学检查

获取受鼠移植心脏，以中性甲醛固定，石蜡包埋制成切片(厚4 μm)，采用苏木精-伊红(HE)染色于光学显微镜下观察。病理学检查排斥反应分级采用Stanford标准。1级：个别或散在少量的淋巴细胞浸润；2级：小灶性侵袭性淋巴细胞浸润或伴有灶性心肌细胞损害；3级：心肌可见多灶性或弥漫性淋巴细胞浸润伴心肌细胞坏死；4级：弥漫性多类型细胞浸润伴有出血、水肿和坏死。

1.5流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在CD3+T细胞中的比例

于移植术后第7天获取各组小鼠脾脏及移植心脏，制备成单个淋巴细胞悬液于RPMI 1640培养液，37℃、5%CO2孵育4 h。取各组T细胞100 μL(1×106个)分别加入FITC-CD4抗体(0.25 μg/106细胞)和PE-CD25抗体(0.125 μg/106细胞)，4℃避光孵育30 min，用冷0.01 mol/L PBS缓冲液洗涤3次，再加入PE-cy5-Foxp3抗体，最后悬浮在400 μL PBS缓冲液中，流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例。

1.6Real-time PCR检测细胞因子表达

根据上述实验结果，分别收集移植术后第3、7、10天anti-IL-6 mAb + anti-CD25 mAb组、anti-IL-6 mAb组小鼠移植心脏，检测IFN-γ mRNA表达情况，实验方法参照试剂盒进行。参照文献设计IFN-γ实时荧光定量PCR引物序列，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.7单项混合淋巴细胞反应(MLR)

使用去增殖的BALB/c或C3H小鼠脾脏淋巴细胞作为刺激细胞，各实验组移植术后第5天受鼠移植心脏来源的淋巴细胞作为反应细胞，混合细胞培养72 h，加入10 μL 3H-TdR，继续培养6 h。固定、脱水，β-液闪仪计数，测定样品放射性cpm值，抑制率=(增殖移植模型组cpm-各组cpm值)/增殖移植模型组cpm×100%。

2结果

2.1各组移植术后脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例变化

淋巴细胞圈门后，CD3+T细胞二次圈门，分析CD4+CD25+T细胞的比例，CD4+CD25+T细胞三次圈门后，分析Foxp3+T细胞的比例(图1A)。结果显示：anti-IL-6 mAb组受鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞比例在术后第7天明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。而anti-IL-17 mAb组受鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞比例在术后第7天与移植模型组及rat-IgG组比较未见明显差异(图1B)。继续分析CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD3+T细胞的比例，可见anti-IL-6 mAb组脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例明显升高，而anti-IL-17 mAb组与移植模型组及rat-IgG组比较未见明显差异，提示anti-IL-6 mAb可有效促进小鼠体内Treg细胞的分化(图1C)。

A：淋巴细胞圈门后，各组Foxp3+T细胞的比例；B：各组受鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞比例；C：各组受鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD3+T细胞的比例；与anti-IL-6 mAb组比较，*P<0.05图1　anti-IL-6 mAb组脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例明显升高Fig.1 Increase of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in the spleen and allograft after anti-IL-6 mAb administration

2.2清除CD4+CD25+T细胞对心脏移植物存活时间的影响

分别于anti-IL-6 mAb组小鼠移植术后第1、3、5天输注anti-CD25 mAb，结果显示：anti-IL-6 mAb组的抗排斥作用被逆转，小鼠移植心脏很快被排斥。anti-IL-6 mAb组小鼠移植心脏平均存活时间为(22.0±2.3)d，而anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb组小鼠移植心脏平均存活时间为(10.6±1.2)d，两组比较差异有统计学意义(图2A)。组织病理学结果提示anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb组术后第7天移植心脏不同程度肿大，与周围组织粘连严重，呈急性排斥反应表现，镜下观察结果显示：心肌组织内有大量炎性细胞浸润，心肌细胞变性坏死严重，其组织病理学表现与移植模型组及rat-IgG组结果相似(图2B)。

A：各组移植心脏存活时间；B：各组移植心脏组织病理学改变图2　各组小鼠心脏移植物存活时间及术后第7天组织病理学改变(HE染色，大图×40，小图×200)Fig.2 Survival time of cardiac grafts of mice in each group and pathological changes of allografts on POD 7(HE staining，×40 for main panels，×200 for insets)

2.3anti-CD25 mAb输注对anti-IL-6 mAb组小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞的影响

anti-IL-6 mAb组小鼠接受anti-CD25 mAb输注与未予anti-CD25 mAb输注的小鼠相比，脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞的比例明显下降(图3A)。进一步研究证实，anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb组小鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降，与单用anti-IL-6 mAb的小鼠比较差异有统计学意义(P<0.05)(图3B)。

2.4anti-CD25 mAb输注对anti-IL-6 mAb组小鼠移植物中IFN-γ mRNA的影响

Real-time PCR结果显示，anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb组移植心脏中IFN-γ mRNA的转录水平明显升高，与单独应用anti-IL-6 mAb的小鼠相比，差异有统计学意义(图3C)。

2.5单项混合淋巴细胞增殖反应(MLR)

使用去增殖的BALB/c或C3H小鼠脾脏淋巴细胞作为刺激细胞，各组受鼠移植心脏来源淋巴细胞作为反应细胞，单向混培后结果示：anti-IL-6 mAb组小鼠淋巴细胞增殖程度较rat-IgG组、anti-IL-6 mAb + anti-CD25 mAb组明显下降，差异有统计学意义，而anti-IL-17 mAb组与rat-IgG组比较MLR结果无明显改变，同时anti-IL-6 mAb组小鼠淋巴细胞针对来自第三方的C3H小鼠脾脏淋巴细胞刺激其MLR结果与rat-IgG组比较亦无明显差异(图4)。

3讨论

我们前期研究已证实anti-IL-6 mAb可以显著抑制移植物中IFN-γ、IL-17和RORγt mRNA的转录水平，而anti-IL-17 mAb可部分抑制移植心脏中IFN-γ mRNA的转录水平[2]，但其作用机制仍有待进一步分析。研究报道IL-6具有抑制CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化的作用[3]。我们应用流式细胞术检测各实验组移植术后第7天脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平的变化。结果显示，小鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞的比例在anti-IL-6 mAb组中显著升高，而anti-IL-17 mAb组与未治疗组比较未见明显升高。已经证实Foxp3是维持CD4+CD25+T细胞分化和功能的重要转录因子，我们的研究结果显示anti-IL-6 mAb组小鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞均高表达Foxp3，因此CD4+CD25+T细胞的水平往往可以反映CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的水平。同时，通过分析CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD3+T细胞的比例，我们发现CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平的变化与CD4+CD25+T细胞比例变化平行，进一步证实了上述观点。以上结果充分证实了CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平的升高在anti-IL-6 mAb抑制移植急性排斥反应及延长小鼠移植心脏存活时间中起着重要的作用。

A：各组受鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞的比例；B：各组受鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD3+T细胞的比例；C：各组受鼠移植心脏中IFN-γ mRNA的表达水平；*P<0.05**P<0.01图3　Anti-CD25 mAb输注对anti-IL-6 mAb组小鼠Treg细胞比例及IFN-γ mRNA表达的影响Fig.3 Effect of anti-CD25 mAb treatment on the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells and the expression of IFN-γ mRNA in anti-IL-6 mAb group

各组单项混合淋巴细胞增殖反应与BALB/c细胞anti-IL-6 mAb组比较，*P<0.05图4　单项混合淋巴细胞增殖反应(MLR)Fig.4 Inhibition of MLR responses in recipients treated with anti-IL-6 mAb

进一步研究发现，通过尾静脉输注anti-CD25 mAb可减少CD4+CD25+T细胞的比例，并逆转了anti-IL-6 mAb所诱导的移植心脏存活时间的延长。尽管有文献报道，anti-CD25 mAb的使用主要是抑制T细胞的活化，而不是清除CD4+CD25+Treg细胞[5]，但同时，也有大量的研究数据显示anti-CD25 mAb可以清除小鼠体内大部分的CD4+CD25+Treg细胞[6]。我们的研究亦证明了小鼠anti-CD25 mAb可以有效清除CD4+CD25+Treg细胞的观点，但其中的机制仍有待进一步研究。已有相关文献报道，通过anti-CD25 mAb清除CD4+CD25+Treg细胞，可以逆转不同治疗条件下诱导的大鼠移植心脏、肝脏、胰腺及肾脏的存活时间[7-8]。

同时，通过流式细胞术检测anti-CD25 mAb处理的anti-IL-6 mAb组小鼠CD4+CD25+Treg细胞的比例，我们发现小鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+T细胞占淋巴细胞的比例明显下降，且CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD3+T细胞的比例较单独应用anti-IL-6 mAb的小鼠明显降低。这一结果说明，尽管CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在anti-IL-6 mAb输注后明显增殖，但给予anti-CD25 mAb处理后，Treg细胞的抑制功能被减弱，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞并没有增殖，反而相对比例明显降低，因此，Treg和效应性T细胞的比例是anti-IL-6 mAb抑制小鼠急性排斥反应的重要因素。有学者在EAE动物模型的研究中发现，清除细胞因子IL-6的小鼠体内Th1和Th17细胞明显减少[4，9]，在我们构建的小鼠急性排斥反应模型中清除IL-6亦得出相似的结果，同时进一步证实了IL-6在Th17细胞分化过程中的关键作用[10-11]。

总之，本研究显示，升高的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在anti-IL-6 mAb延长移植心脏存活中起着重要的作用，使用anti-CD25 mAb降低CD4+CD25+T细胞水平后，加速了移植器官的排斥反应，并且伴随移植物中IFN-γ mRNA转录水平的上升，从而为抑制移植急性排斥反应的发生发展提供了新的思路和策略。

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(2015-01-13收稿)

Role of CD4+CD25+Foxp3+Regulatory T Cells in Anti-IL-6 mAb-expanded Survival of Mouse Cardiac Grafts

Lei Jun，Chen Leifeng，Liu XiuxiaetalDepartmentofSurgery，TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China

AbstractObjectiveTo examine the role of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in acute rejection of allogeneic cardiac grafts in anti-IL-6 mAb treated mice and the mechanism.MethodsThe cardiac transplant models were established in mice.Animals were randomly divided into transplant model group，transplant control group，anti-IL-17 mAb group and anti-IL-6 mAb group.The anti-IL-6 mAb，anti-IL-17 mAb or rat-IgG was administered to recipient mice after cardiac grafting in the transplant control group，anti-IL-17 mAb group and anti-IL-6 mAb group，respectively.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells was determined in the allograft and spleen on postoperative day(POD)7 by flow cytometry.Allografts were observed for their survival time and histological changes.Allografts of recipients were collected at 3，7 and 10 days after treatment with anti-CD25 mAb，and then subjected to real-time PCR for the expression of IFN-γ.The proliferation of lymphocytes was observed，with mitomycin-treated BALB/c or C3H splenocytes used as stimulator cells，and T cells from recipients as responder cells.ResultsThe proportion of CD4+CD25+T cells were significantly increased on POD 7 in anti-IL-6 mAb group，and the percentage of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in the CD3+T-cell pool also showed an increasing pattern.There were no significant differences in the proportion of CD4+CD25+T cells and the percentage of CD4+CD25+Foxp3+regulatory Tcells between anti-IL-17 mAb and transplant model groups.Administration of anti-CD25 mAb to anti-IL-6 mAb-treated mice shortened the mean survival time(MST)of allografts to (10.6±1.2)d，decreased the proportion of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells，and increased the expression of IFN-γ.Mixed lymphocyte culture showed that graft infiltrating lymphocytes(GILs)were profoundly inhibited in anti-IL-6 mAb group after stimulation with donor cells as compared with those in transplant control，anti-IL-6 mAb+anti-CD25 mAb and transplant model groups.The inhibitory effect on GIL proliferation wasn’t found after stimulation with third-party cells.ConclusionAnti-IL-6 mAb prolongs the survival of mouse allografts possibly by increasing the proportion of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells and decreasing the expression of IFN-γ in the spleen and cardiac graft of mice.

Key wordsacute rejection；heart transplantation；anti-IL-6 mAb；anti-CD25 mAb；regulatory T cells；IFN-γ

中图分类号：R654.28

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.009

*江西省自然科学基金资助项目(No.20114BAB215011)；江西省科技计划资助项目(No.20122BBG70113)

雷钧，男，1979年生，主治医师，医学博士，E-mail：manderly123@sina.com