使用交联剂DMP消除免疫沉淀非特异性条带*

张　敏，　刘裕禄，　张　春，　熊　敏，　刘建社，　姜华军△

1华中科技大学同济医学院附属荆州医院肾内科，荆州　434020

2华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科，武汉　430022



使用交联剂DMP消除免疫沉淀非特异性条带*

张敏1，刘裕禄2，张春2，熊敏2，刘建社2，姜华军2△

1华中科技大学同济医学院附属荆州医院肾内科，荆州434020

2华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科，武汉430022

摘要：目的消除免疫沉淀技术中免疫印迹检测到的非特异性条带，排除非特异性条带对研究蛋白质分子相互作用及磷酸化的干扰。方法检测蛋白交联剂庚二亚氨酸二甲酯(DMP)交联抗体和载体基质的稳定性及交联效果；积极寻找和优化抗原析出条件，分离出免疫沉淀复合物中抗原成分；检测析出抗原特异性条带及磷酸化水平。结果DMP有效地将抗体共价结合于载体基质，具有较好的稳定性和交联效果，其免疫沉淀中未检测到非特异性蛋白条带；与Laemmli缓冲液相比，甘氨酸可有效地一次性析出免疫沉淀中大部分抗原；经pH值调整后，析出抗原的浓度及磷酸化水平无明显变化。结论交联剂DMP能有效地消除传统免疫沉淀技术中检测到的非特异性蛋白条带，且能应用于蛋白质磷酸化的检测。

关键词：免疫沉淀；蛋白质相互作用；蛋白质磷酸化

免疫沉淀是通过把抗体结合到某些可沉淀的基质，如蛋白A/G磁珠，利用抗原抗体特异性反应富集待测样本中目的蛋白的一种方法。这种结合抗体的基质与目的蛋白形成的复合物在高温和还原剂的作用下，抗原抗体解离，通过离心收集上清可得到目的蛋白。尽管如此，分离的目的蛋白中仍混有抗体及抗体片段和少量的杂蛋白，使得电泳显影后出现非特异性条带和拖尾的现象[1]。当目的蛋白条带与非特异性条带接近或者目的蛋白特异性条带信号微弱时，研究者不得不再寻他径，从而可能遗失重要的发现或提示，如分子间的相互作用及磷酸化水平。足细胞是肾脏肾小球脏层上皮细胞，高度分化，结构复杂，在肾小球滤过屏障中起重要作用[2]。本研究小组在使用免疫沉淀方法研究足细胞相关分子生理功能中，通过引入交联试剂庚二亚氨酸二甲酯(dimethyl pimelimidate，DMP)将抗体与基质载体交联，可不改变抗原析出时的浓度，消除非特异性条带，使部分不适用于免疫沉淀的抗体变得可用；与传统方法相似，能用于免疫印迹水平的蛋白质定量和磷酸化水平的检测。现对上述DMP交联优化方法作一介绍，供同行参考。

1材料与方法

1.1主要试剂

蛋白A/G磁珠购自Thermo公司(美国)；DMP、乙醇胺、三乙醇胺、正钒酸钠(sodium vanadate)、Calyculin A、牛肝过氧化氢酶和兔抗Podocin抗体购自Sigma公司(美国)；小鼠抗CD2AP(B-4)单克隆抗体、兔抗CD2AP(H-290)多克隆抗体、兔抗nephrin(H-300)多克隆抗体和兔抗磷酸酪氨酸(pTyr)多克隆抗体均购自Santa Cruz公司(美国)；Laemmli缓冲液购自BioRad公司(美国)；蛋白酶抑制剂Cocktail购自Roche公司(美国)；阴性对照抗体小鼠免疫球蛋白和兔免疫球蛋白购自Dako公司(丹麦)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2DMP交联抗体与基质

取300 μL蛋白A或G磁珠，PBS洗3次，加入1 mg/mL BSA于4℃封闭10 min，离心弃去上清后加入3.0 μg相应抗体，4℃孵育过夜。离心后弃去上清，用1 mg/mL BSA洗1次，PBS洗3次。离心弃上清后加入临时配制的13 mg/mL DMP(pH 8~9)，室温下孵育30 min，离心弃上清后用0.2 mol/L三乙醇胺离心洗3次，重复使用DMP，共交联3次。50 mmol/L乙醇胺离心洗2次，1 mol/L甘氨酸(pH 3.0)离心洗2次，以去除游离的抗体。离心弃上清后用免疫沉淀缓冲液(50 mmol/L HEPES pH7.5，150 mmol/L NaCl，10%甘油，5 mmol/L MgCl2，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，30 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，1%Triton X-100)洗3次后备用。

为检测基质-抗体-DMP交联复合体的稳定性，以未用DMP交联的基质-抗体复合物为对照。通过上述方法制备DMP交联或未被交联的蛋白A磁珠-兔免疫球蛋白复合物，加入免疫沉淀缓冲液(pH 8.0)4℃过夜，4℃下10 000 r/min离心1 min，取等体积上清加入7.5%SDS-PAGE凝胶电泳，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔1∶3 000进行免疫印迹检测。

为检测DMP交联次数对基质-抗体-DMP交联复合体的影响，在通过上述方法制备基质-抗体-DMP交联复合体中，分别用DMP交联1~3次。经免疫沉淀缓冲液洗净后离心，加入150 μL Laemmli缓冲液和0.1 mol/L DTT 85℃煮沸5 min，离心后取上清加入7.5%SDS-PAGE凝胶电泳，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔1∶3 000进行免疫印迹检测。

1.3甘氨酸析出产物pH的调节

取300 μL蛋白A或G磁珠，PBS洗3次，离心去上清后加入5 mL 1 mol/L甘氨酸(pH3.0)。充分混匀后离心，取3 mL上清，加入10 μL 10 mol/L NaOH，用pH计测定其调节后的pH值，重复加入10 μL 10 mol/L NaOH，直至上清pH值调节至7~9之间。重复5次，计算3 mL 1 mol/L甘氨酸pH由3.0调节至7~9所需10 mol/L NaOH的量。

1.4免疫沉淀及免疫沉淀复合物中抗原的析出

条件永生化小鼠足细胞是从H-2Kb-tsA58转基因小鼠肾脏中分离后建立的细胞系，由本实验室保存。足细胞培养方法同前期工作[3]。正常培养于预铺有Ⅰ型胶原10 cm培养皿的足细胞，加入1.5 mL含蛋白酶抑制剂的免疫沉淀缓冲液，4℃14 000 g离心15 min，留取上清。取200 μL上清，加入400 μL含0.1 mol/L DTT的Laemmli缓冲液，85℃煮沸5 min，此即全细胞裂解液样本(Whole cell lysate，WCL)。取剩下上清，加入洗净的未结合抗体的蛋白A/G磁珠，4℃孵育30 min，离心后保留上清，加入预先配制的经DMP交联的蛋白A/G磁珠-抗体复合物，4℃避光下孵育2 h。离心后弃上清，用免疫沉淀缓冲液洗3次，离心后的沉淀即为含特异性抗原的蛋白A/G磁珠-抗体复合物。

将上述含特异性抗原的蛋白A/G磁珠-抗体复合物分别用150 μL 1 mol/L甘氨酸(pH3.0)和150 μL Laemmli缓冲液在56℃下孵育30 min。离心取上清，调节pH值8.0左右，再按1∶2体积加入含0.1 mol/L DTT的上样缓冲液，85℃煮沸5 min使蛋白变性，后行10%SDS-PAGE凝胶电泳。

1.5Western blot检测

样本经10%SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉-TBST室温封闭90 min。一抗分别为1∶1 000稀释的小鼠抗CD2AP(B-4)单克隆抗体、兔抗CD2AP(H-290)多克隆抗体和兔抗Podocin抗体，37℃孵育2 h或者4℃孵育硝酸纤维素膜过夜。用相应的1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2 h，用ECL化学发光剂在暗室使X线胶片曝光、显影、定影。

1.6蛋白磷酸化水平检测

根据文献[4]方法使用正钒酸钠、双氧水和牛肝过氧化氢酶制备40 μmol/L钒酸。弃去培养于10 cm培养皿足细胞的培养液，用新鲜培养液洗1次，加入5 mL含40 μmol/L钒酸和50 nmol/L Calyculin A的50 mmol/L HEPES，37℃孵育15 min。加入1.5 mL含蛋白酶抑制剂的免疫沉淀缓冲液裂解细胞，将获得的WCL分别与经DMP交联的蛋白G磁珠-nephrin抗体4℃孵育2 h。按上述操作使用甘氨酸析出相应抗原后行10%SDS-PAGE凝胶电泳。兔抗磷酸酪氨酸(pTyr)多克隆抗体检测免疫沉淀中nephrin的磷酸化水平。

1.7统计学方法

2结果

2.1免疫沉淀检测足细胞相关抗原的表达

结果见图1。使用单克隆CD2AP抗体检测到：在全细胞裂解液样本中76 kD处有一清晰条带；而在免疫沉淀获得的样本中50 kD附近有2条非特异性条带；无关抗体——小鼠抗GFP IgG2α单克隆抗体作为对照(图1A)。同样，使用多克隆CD2AP抗体亦可检测到免疫沉淀样本中非特异性条带；无关抗体——兔多克隆免疫球蛋白IgG作对照(图1B)。无论是使用单克隆抗体/蛋白G磁珠还是使用多克隆抗体/蛋白A磁珠体系，均在免疫沉淀中检测到非特异性条带。

A：使用单克隆抗体检测CD2AP；B：使用多克隆抗体检测CD2AP；WCL：全细胞裂解液；IP：免疫沉淀；小鼠抗GFP IgG2α单克隆抗体和兔多克隆免疫球蛋白IgG作对照图1　使用单克隆抗体和多克隆抗体检测全细胞裂解液和免疫沉淀物中CD2AP的表达Fig.1 Detection of the expression of CD2AP from whole cell lysates and immunoprecipitates by using monoclonal and polyclonal antibody

2.2本研究中免疫沉淀方法的改进

传统的免疫沉淀方法常用蛋白A/G磁珠与抗体形成复合物，然后去沉淀待测样本中的特异性抗原，经高温和还原剂作用，分离出目的蛋白含有变性后的抗体成分(图2A)。本研究中采用交联剂DMP将蛋白A/G磁珠与抗体进行交联，沉淀待测样本中的特异性抗原后，在适当的析出条件下，得到成分比较单一的目的蛋白(图2B)。

2.3基质-抗体复合物的稳定性及DMP交联效果

为检测基质-抗体复合物的稳定性，经过4℃过夜处理。未被DMP交联的复合物上清中可检测到150 kD大小的特异性条带，此即为从复合物上解离的抗体。而经DMP交联后，上清中未能检测到相应的条带(图3A)。

为检测DMP交联次数对形成复合物的影响，将基质-抗体复合物用DMP分别交联1~3次，经85℃高温和还原剂处理后电泳。DMP交联后的复合物解离的成分明显多于未交联的对照组，交联1次与3次无明显差别(图3B)。

2.4甘氨酸析出产物pH的调节结果

在pH计的指示下调节析出产物的pH值，将3 mL pH3.0的析出产物调节pH值至约8.0，需要50 μL10 mol/L NaOH(表1)。由此可计算出：析出产物和NaOH之间的体积比为60∶1(3 mL∶50 μL)；pH调节前后产物浓度比例为1∶0.98，无明显变化。

2.5抗原的析出

使用甘氨酸和Laemmli缓冲液均可以析出免疫沉淀复合物中的CD2AP抗原，在76 kD处得到清晰的无拖尾的蛋白条带，消除了传统免疫沉淀法中出现的非特异性蛋白条带。阴性对照中无任何条带出现(图4)。

A：传统免疫沉淀步骤；B：本实验中改进的免疫沉淀步骤；：蛋白A/G磁珠；：单克隆/多克隆抗体；：交联剂DMP；▲：抗原；：洗脱后的抗体图2　免疫沉淀技术改进前后步骤示意图Fig.2 Schematic diagram of immunoprecipitation technique before and after improvement

NaOH(μL)01020304050pH3.00±0.003.17±0.013.36±0.023.65±0.024.39±0.038.09±0.05

A：检测基质-抗体复合物的稳定性；B：检测DMP交联次数对形成复合物的影响；对照：为未使用交联剂的蛋白A/G-抗体复合物；DMP：使用DMP交联后的蛋白A/G-抗体复合物；DMP×1：交联1次；DMP×3：交联3次图3　蛋白A/G磁珠-抗体复合物的稳定性及DMP的交联效率Fig.3 Detection of the stability of protein A/G beads-antibody and the effectiveness of DMP in cross-linking

2.6析出效果分析

结果见图5。分别使用甘氨酸和Laemmli缓冲液析出免疫沉淀中的CD2AP抗原各3次，将获得的蛋白条带灰度值除以3次蛋白条带灰度值的和来反映每次的析出效率。使用一次甘氨酸即可析出大部分抗原，约(75.67±5.92)%(图5A)，而使用一次Laemmli缓冲液仅能析出(45.60±4.33)%的抗原，仍有较多抗原保留在免疫沉淀复合物中(图5B)。

CD2AP分别由甘氨酸和Laemmli缓冲液从免疫沉淀物中析出，WCL作为阳性对照，小鼠IgG2α用作阴性对照图4　使用甘氨酸和Laemmli缓冲液析出抗原Fig.4 Elution of the antigens with glycine and Laemmli buffer separately

2.7应用于非适合免疫沉淀的抗体

结果见图6。多克隆兔抗Podocin抗体未被推荐应用于免疫沉淀。在细胞裂解液样本中，特异性Podocin条带出现在50 kD处；在免疫沉淀样本中有多条非特异性条带，以兔IgG作对照，示50 kD处非特异性条带与特异性Podocin条带基本重叠(图6A)。使用经DMP交联的蛋白A磁珠，在免疫沉淀中用甘氨酸析出抗原，可检测到特异性Podocin抗体条带，阴性对照中可见非特异性条带已被消除(图6B)。

A：使用甘氨酸分别析出3次的CD2AP；B：使用Laemmli缓冲液分别析出3次的CD2AP；获得的蛋白条带灰度值除以3次蛋白条带灰度值的和来反映每次的析出效率，如柱形图所示图5　使用甘氨酸和Laemmli缓冲液析出抗原效果的比较Fig.5 Comparison of the elution efficacy between glycine and Laemmli buffer

A：使用非交联的蛋白A磁珠检测的Podocin；B；使用交联的蛋白A磁珠检测的Podocin；WCL用作阳性对照，兔抗多克隆IgG为阴性对照图6　使用交联剂和非交联剂检测非特异性条带附近的PodocinFig.6 Detection of podocin by immunoprecipitation using non-cross-linker and cross-linker

2.8应用于检测蛋白质磷酸化

Nephrin是肾脏足细胞的结构分子，也在细胞信号转导中发挥着作用，其分子结构中具有多个磷酸化位点。使用未经DMP交联的蛋白G磁珠检测nephrin的磷酸化，可见在200 kD处的特异性蛋白条带，此即磷酸化的nephrin。在阴性对照中未出现该特异性条带。50 kD处可见非特异性的条带(图7A)。经过DMP交联、甘氨酸洗脱，仍可在200 kD处检测到清晰的磷酸化nephrin条带，同时消除了50 kD处的非特异性条带(图7B)。

3讨论

免疫沉淀是初步建立于19世纪70年代的一种实验室技术，经过多年的发展和完善已经衍生出多种技术广泛应用于分子生物学等领域的研究。抗体、基质载体、抗原识别、相关干扰等是选择实施该技术需要考虑的基本环节。本研究小组在长期的免疫沉淀技术操作中，初步建立了一套行之有效的方案来减少非特异性条带的干扰，保证了实验数据不失真，为进一步研究分子间的相互作用和磷酸化种类及位点等打下了基础。

蛋白A或G磁珠是常用的固态基质载体，蛋白A和蛋白G分别来源于金黄色葡萄球菌和链球菌，它们均以共价键牢固结合于磁珠，这是其作为可沉淀基质载体的优势之一[5]。抗体与蛋白A或蛋白G为非共价结合，导致抗体或其裂解的重链及轻链可在免疫印迹中被检测到，形成非特异性条带。这在我们的结果中得到了证实，无论是使用单克隆抗体或者是多克隆抗体，均可出现非特异性条带。因此，可以设想，如果将蛋白A或蛋白G与抗体牢固结合，就可以析出相对较纯的抗原。DMP具备将两种相互作用的蛋白质共价结合的功能，但因其易于水解、需要苛刻的pH环境使其目前较少作为交联剂用于免疫沉淀[6]。考虑到DMP有较好的交联可逆性，我们仍选择了DMP作为交联剂。通过与未交联的蛋白A/G磁珠相比较，DMP交联后，很少有抗体从复合物上解离；DMP交联1次即可达到理想的效果。

洗脱液的选择是抗原析出的关键。目前较常用的是pp~3的甘氨酸和Laemmli缓冲液[7]。为此，我们比较了这2种洗脱液析出抗原的效果。结果显示，甘氨酸较Laemmli缓冲液有更好的析出效果。这可能与DMP的可逆性及Laemmli缓冲液的蛋白质变性能力有关[6，8]。值得注意的是，使用甘氨酸洗脱抗原后产物呈酸性，在进行凝胶电泳前需调整其pH至8.0左右，以避免损伤凝胶。使用高浓度氢氧化钠可快速调节pH，且对抗原浓度的影响较少。同时我们的结果还显示，使用DMP交联剂后，无论用哪种方法，在50 kD处的非特异性条带完全消失，这显然与交联剂的作用密不可分。

A：使用非交联的蛋白磁珠；B：使用DMP交联的蛋白磁珠；兔抗磷酸酪氨酸多克隆抗体用于检测免疫沉淀物中nephrin的磷酸化；WCL用作阳性对照，兔抗多克隆IgG为阴性对照图7　经DMP交联的蛋白磁珠用于检测蛋白的磷酸化Fig.7 Application of DMP cross-linked protein beads to protein phosphorylation detection

减少非特异性条带的干扰，是我们改进实验方法的目的。这为我们研究50 kD处其它目的分子的功能打下了基础。Podocin是肾脏足细胞的重要分子，其分子量在40~50 kD之间。通过上述方法，我们得到了podocin分子特异的蛋白条带，这是传统方法所不能的。最后我们还检测了肾脏足细胞的另外一种重要分子nephrin，其介导的分子信号可能在细胞粘附、存活中起重要作用。结果显示，通过使用DMP交联，同样能检测出蛋白磷酸化水平，同时又消除了非特异性条带的干扰。本研究中既使用检测了单克隆抗体，又使用了多克隆抗体，同时检测了不同分子量的蛋白质，提示其具有较好的使用范围。由于清除了在50 kD处的非特异性条带，因此具有很好的推广价值。

总之，我们认为，在使用免疫沉淀技术中，若我们感兴趣的目的蛋白条带可能被非特异性条带干扰时，不妨使用DMP，将抗体与蛋白A/G磁珠交联；该优化方法既可行定量研究，又可行磷酸化检测，具有重要的应用价值。

参考文献

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(2015-02-03收稿)

Removal of Nonspecific Bands in Immunoprecipitation Measurement by Using DMP，a Cross-linker

Zhang Min1，Liu Yulu2，Zhang Chun2etal

1DepartmentofNephrology，JingzhouHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Jingzhou434020，China2DepartmentofNephrology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo eliminate the interference of nonspecific bands on the detection of protein interaction and phosphorylation by removing the nonspecific bands in proteins purified by immunoprecipitation technique.MethodsThe protein cross-linker dimethyl pimelimidate(DMP)was used to cross-link the antibody and protein matrix.The stability and the effectiveness of DMP in cross-linking were detected separately.The conditions for the elution of antigens from immunoprecipitated compounds were optimized.Specific bands and phosphorylated levels of target antigens were measured by Western blot.ResultsThe antibody and protein matrix were cross-linked covalently by DMP with good stability and effectiveness found.Western blot revealed that nonspecific bands were removed by using the cross-linking protein beads.Glycine could effectively elute most of the antigens from the immunoprecipitated compounds for only once，when compared with Laemmli buffer.There were no apparent changes in the concentrations and phosphorylated levels of the antigens after the adjustment of pH value.ConclusionDMP can effectively remove the nonspecific bands in immunoprecipitation measurement，and it can be used for protein phosphorylation detection.

Key wordsimmunoprecipitation；protein interaction；protein phosphorylation

中图分类号：R392

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.006

通讯作者△，Corresponding author，E-mail:jianghuajununion@126.com

*国家自然科学基金资助项目(No.30900682)

张敏，女，1986年生，主治医师，医学硕士，E-mail:17707165522@163.com