免疫检测技术及其研究进展

牛童　曾家豫　廖世奇　马瑾　袁红霞　马梅兰

·综述·

免疫检测技术及其研究进展

牛童曾家豫廖世奇马瑾袁红霞马梅兰

免疫检测技术是一种以抗原抗体特异性识别和结合为原理对样品中特定的目标物进行定性定量测定的分析方法，其在临床医学、现代生命科学、食品科学、生态学等领域发挥着重要作用。本文主要综述近几年应用比较广泛的免疫学检测方法及其研究近况。

免疫学检测技术；酶标记；荧光素标记；放射免疫

1959年美国物理学家Berson和Yallow使用放射免疫检测技术（Radioimmunoassay，RIA）检测出血清中的微量胰岛素，从而免疫检测技术被引入分析化学界［1，2］。

免疫检测技术的基本原理就是利用抗原与抗体之间的特异性和灵敏性反应，即以一种抗体或多种抗体作为反应的分析试剂［2，3］，进而对待测物进行定性及定量分析［2，4］。目前应用比较广泛的免疫检测方法有：免疫沉淀（immunoprecipitate，IP），分子印迹技术（molecular imprinting technique，MIT）［2］，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），免疫PCR［5］，免疫荧光技术（immunofluoreseence assay，IFA），免疫层析技术，免疫磁珠分离技术［6］，免疫传感器（（immunosensor）［7］等。

1　免疫荧光技术

免疫荧光技术就是指用荧光色素对目标物标记后，再对其进行定性定量检测的一种实验技术［8］。其基本原理就是抗体和抗原发生特异性结合后，使用荧光显微镜对待测物进行观察和鉴别。其基本操作步骤是先制备荧光标记物（荧光抗体或抗原），即在已知的抗体或者抗原上标记上相应的荧光素，再将这种荧光标记物（荧光抗体或抗原）注入到细胞内部作为探针，当它们进入细胞后即可和细胞内相应的抗原或抗体发生特异性结合，此时使用荧光显微镜来观察标本是否能发出荧光，以此来对细胞内相应的抗体或者抗原进行定位和检测［6］。

在临床应用中免疫荧光技术的作用方式主要有两种，一种是放射免疫分析法，另一种是时间分辨免疫荧光分析法。竞争反应是放射免疫分析技术的主要利用原理，这种检测方法曾被人认为是“最具发展潜力的免疫检测技术”［9］。时间分辨免疫荧光分析法能够对同位素和酶进行标记。另外，其在试验中所需试剂的存放时间较长，所需的实验材料制作起来比较简单，因此有人将它称为“免疫检测技术中的新成果”［10］。

随着免疫荧光技术应用范围的不断扩大，其在免疫学、现代分子生物学、环境科学等领域都有所涉及［11］。另外，免疫荧光技术也在微生物学领域发挥着一定的作用，有人［12］已经用免疫荧光技术快速检测葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌等细菌。

2　免疫层析技术（胶体金免疫层析技术）

免疫层析技术是免疫学上用于检测分析的一种色谱分析方法。其利用的是抗原-抗体特异性吸附的原理，该技术操作简单，能够在较短的时间内对待测物进行检测。目前在免疫层析技术中，使用比较好的有胶体金免疫层析技术［13］。

胶体金免疫层析技术是一种将层析分析技术、胶体金标记技术、免疫检测技术三者相结合的固相标记免疫检测技术，其也是将抗原抗体反应和胶体金标记技术有机结合的一种应用形式，它是借助毛细作用使得以条带状固定在膜上的特异性抗原或抗体发生泳动，同时使得层析条带上针对待测物的受体（如抗体或抗原）与样品中的待测物发生高亲和性、高特异性的免疫反应，层析反应过程中免疫复合物被截留或者富集在层析条的检测带区域，最后通过着色标记物或者利用酶促反应快速、直观地检测出待检物质。

胶体金免疫检测技术广泛应用于核酸、杀虫剂、蛋白质、激素、药物和毒素等的检测。如Boyle T［14］利用胶体金免疫检测技术评价酸奶、巧克力、婴儿配方奶粉、冰淇淋中的葡萄球菌中的肠毒素。

3　酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术（ELISA）是把酶的高效催化作用与抗原抗体的特异性反应有机结合起来的一种新型的免疫检测技术，该方法既可以检测抗体，也可以检测抗原［15］。其基本原理就是先用酶标记抗体，再进行抗原抗体反应，最后酶通过分解底物而显色，根据颜色的深浅来判断待检测的抗原和抗体的含量。ELISA主要有两大类：传统ELISA方法和新型ELISA方法［16］。传统ELSIA法有：间接ELISA（I-ELISA）、固相竞争ELSIA（SC-ELISA）、间接夹心ELISA（IS-ELISA）等。新型ELISA法有：单克隆抗体ELISA（（McAb-ELISA）［17］、PT-PCR ELISA、Dot-ELISA［18］等。

ELISA法具有操作简单、稳定性好、特异性高、可大批量检测样品等优点，因其检测成本较低，故比较适合现场检测，尤其适用于食品中微量过敏原的检测。吴序栎等人就曾利用双抗体夹心法ELISA以其最低检出限：40ng/ml检测出了食品中虾过敏原蛋白成分［19］。但是ELISA法也有其一定的局限性，如抗体制备难、无法进行多残留检测、对结构类的化合物存在一定的交叉反应［20］，另外实验结果也会出现假阳性。

4　电化学免疫传感器

电化学免疫传感器［7］是免疫传感器中种类最多、研究最早、也比较成熟的一种检测技术。它是将电化学技术与免疫检测技术相结合，用电化学信号来反应待检测物质的浓度，从而对待分析物进行分析测定的一种检测方法，它由换能器（基本电极）和分子识别物质（抗原、抗体）组成。因为其有不同的检测方式，故将电化学免疫传感器分为以下几种类型：阻抗型、电容型、电位型、电流型。

4.1阻抗型免疫传感器阻抗型免疫传感器具有高度的特异性，它是通过阻抗谱对于传感界面变化的灵敏度来检测待测物的浓度的一种免疫检测方法。Yang［21］等曾经将葡萄糖氧化酶和HRP固定在纳米材料上作为生物催化剂，催化过氧化氢氧化4-氯萘酚，建立了一种检测甲胎蛋白的阻抗型免疫传感器。

4.2电容型免疫传感器电容型免疫传感器的测量原理比较简单，其建立依据主要有两个方面：一个消耗离子所引起的溶液导电性变化，另一个是免疫生化反应的发生。表面电荷的改变和物质的吸附对双电层结构有显著的影响。

4.3电位型免疫传感器电位型免疫传感器是通过测定抗原抗体特异性反应过程中电位的变化而进行免疫分析的一种检测方式。因为检测溶液的多离子性及其离子浓度之间的复杂性，该方法检测的结果有较大的不确定性。

4.4电流型免疫传感器电流型免疫传感器是在电压恒定的情况下测定抗原抗体特异性反应中电流变化的一种免疫检测方式。主要有两种类型：非酶标记性和酶标记型。

5　免疫磁珠分离技术

免疫磁珠是一种既能结合活性蛋白（如抗原、抗体）又能被磁力所吸引的磁性微球，其表面包被了各种化学基团，以使得可以和别的物质发生结合。而免疫磁珠分离技术［6］的基本原理就是将包被有抗体的磁珠与致病微生物（如抗原）结合，形成抗原抗体复合物，而包被有抗原的磁性微球就会因磁力的吸引而发生聚集，从而使得致病微生物与抗体形成的复合物与其它物质分开，以达到分离致病微生物的目的。国家检验标准《食品卫生微生物学检验》已经把免疫磁珠分离技术作为大肠杆菌O157:H7/MM的检验方法［22］。

6　分子印迹技术

分子印迹技术（MIT）是一种模拟抗原抗体反应合成特异性选择识别位点的实验技术［23］，其在固相萃取、有机合成、免疫传感器等领域有着重要的应用前景［24］。

分子印迹技术也有一些缺陷，如在极性溶剂或水溶液中该技术依旧不能很好地应用。故该技术目前还是主要用于小分子化合物的检测。

7　结语

免疫检测技术在临床医学领域和生物学领域中发挥着极其重要的作用，这些方法虽然具有快速、灵敏度高等优点，但也存在操作方法较繁琐、信息量少、容易出现假阳（阴）性等缺点。如，电化学免疫传感器因为其易于微型化、简单、灵敏而曾被认为是AFP（甲胎蛋白）的有效检测手段，但是迄今为止，它仍处于其发展的早期阶段，未能得到广泛使用。再如，胶体金免疫层析技术具有检测结果直观、快速、不需要特殊设备、无污染等优点，适合于大面积普查和大批量检测，非常适合于食品安全检测，但是目前国内市场上还没有成型的胶体金免疫层析产品。

总的来说，大部分的免疫检测技术仍处于其研究的初级阶段，要使得这些技术能够广泛的使用，我们仍需要在精确度和灵敏度的提高、操作的经济性和简便性、稳定性的保持等方面加强研究。我们相信，免疫检测技术将不断朝着简单、灵敏、快速、标准的方向发展，为临床医学、生物学、食品科学、环境科学等领域做着极其重大的贡献。

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